廣州地區(qū)產(chǎn)imp-9金屬酶銅綠假單胞菌的同源性分析

廣州地區(qū)產(chǎn)imp-9金屬酶銅綠假單胞菌的同源性分析

銅綠假單胞菌是醫(yī)院感染的重要病原體。它可以在醫(yī)院環(huán)境中長期存在。特別是如果身體阻力降低或免疫功能受損，相關(guān)的醫(yī)院感染可能會持續(xù)。由于存在多種耐藥機制,臨床表現(xiàn)為多重耐藥性。2005~2007年廣州地區(qū)多家醫(yī)院曾出現(xiàn)產(chǎn)IMP-9金屬酶銅綠假單胞菌的爆發(fā)流行有該流行株的存在,我們收集了2007年10月到2008年11月廣州地區(qū)7家醫(yī)院出現(xiàn)的對所有常見抗菌藥物耐藥的銅綠假單胞菌泛耐株(PDR)共269株,從中篩選出產(chǎn)IMP-9金屬酶的菌株,并以2005年爆發(fā)克隆株作參考,了解產(chǎn)IMP-9金屬酶銅綠假單胞菌的分子同源性。1材料和方法1.1菌株鑒定及鑒定菌株收集2007年10月至2008年11月廣州地區(qū)7家大型醫(yī)院所保留的銅綠假單胞菌多重耐藥株共269株。陽性對照株為2005年出現(xiàn)爆發(fā)流行的產(chǎn)IMP-9克隆株2376。銅綠假單胞菌ATCC27853為陰性對照株。菌種鑒定采用VITEK2系統(tǒng)(Biomerieux,法國)。主要儀器和試劑LambdaLadderPFGMarker購自美國NEB公司、PCR引物和序列分析均由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成和檢測、梯度PCR儀購自德國Eppendorf公司、GEL-DOCXR凝膠成像系統(tǒng)購自美國BioRad公司。1.2制備菌體模板DNA的抽提(1)取大約0.2ml培養(yǎng)物加入離心管中,6000r/min離心2min沉淀菌體;(2)盡量將所有上清吸去,加入200μl的無菌水,混勻菌體;(3)100℃煮沸10min,置4℃10min,8000r/min離心10min,棄沉淀,上清液為模板。采用PCR方法篩查目標(biāo)菌株的blaPCR產(chǎn)物測序PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送上海英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序,測序結(jié)果采用GeneBank中的BLAST程序進(jìn)行對比分析。ERIC-PCR分子流行病學(xué)分型患者臨床資料分析回顧性分析了10例攜帶IMP-9金屬酶銅綠假單胞菌患者的病例資料,了解其基本情況、診療經(jīng)過、細(xì)菌學(xué)檢查等。2結(jié)果2.1imp陽性對照株的鑒定菌株985,3798,1401,1245,1380,447,2949,4530,4555,3768和IMP-9陽性對照株2376在約490bp處出現(xiàn)相同的條帶(見圖1),通過對985,3798號菌株的IMP-9基因PCR陽性產(chǎn)物進(jìn)行正向測序,經(jīng)ClustalW程序分析,其核酸序列與GenBank已登陸的bla2.2不同基因型的a、b、c型的分子身份證菌株1245,1380,1401,3798為A1型,985為A2,3768,4555,4530為A3,447為A4型,2949為A5型,均為A克隆,為同一基因型,陽性對照株2376為B型,A,B型之間的相似度低于80%,故分屬不同克隆(圖2)。2.3機械通氣和纖支鏡檢查10株IMP-9金屬酶銅綠假單胞菌均來自同一家醫(yī)院A醫(yī)院的痰標(biāo)本,其中來自于ICU病房4株,呼吸內(nèi)科普通病房4株,胸外科2株,其中來自ICU的患者均為有接受機械通氣和纖支鏡檢查的病史,其余6位都曾接受過纖支鏡檢查。編號447,2949,3768,3798共4位患者在2005年至2007年初即廣州地區(qū)多家醫(yī)院出現(xiàn)產(chǎn)IMP-9金屬酶銅綠假單胞菌的爆發(fā)流行期,曾分別入住過A院呼吸內(nèi)科,住院時間均在3個月以上,在上述住院期間均接受過機械通氣或纖支鏡檢查,并且在痰標(biāo)本中曾經(jīng)分離出銅綠假單胞菌。所有10位患者都存在1種或1種以上嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病:重癥肺炎、慢性阻塞性肺氣腫、腫瘤化療或放療后和肺移植術(shù)后等(表1)。3攜帶imp-9克隆株的臨床分型2005年3月至2007年3月期間,我們曾對廣州地區(qū)4家大型醫(yī)院進(jìn)行銅綠假單胞菌泛耐株的同源性檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)IMP-9金屬酶銅綠假單胞菌克隆株的爆發(fā)流行,并且該克隆株主要集中在A醫(yī)院從本次調(diào)查的結(jié)果發(fā)現(xiàn),IMP-9克隆株仍然存在,且仍然集中于A醫(yī)院,但與前期發(fā)現(xiàn)的爆發(fā)流行陽性對照株2376分屬不同克隆。本次發(fā)現(xiàn)的攜帶IMP-9克隆株的10位患者,有4位曾在2005年3月至2007年3月,即IMP-9金屬酶銅綠假單胞菌的爆發(fā)流行期間入住過A醫(yī)院,住院時間從3個月到半年不等,而其余6位患者均在2007年11月后首次入住A院。所有10位患者,住院期間均接受過至少一次機械通氣或纖支鏡等的侵入性器械檢查。4位曾入院患者在IMP-9克隆株爆發(fā)流行期間也曾分離出泛耐的銅綠假單胞菌,且其耐藥表型和本次分離株基本相同,對碳青霉烯類,第三代頭孢菌素類,氨基糖苷類,喹諾酮類均耐藥,但由于菌株的遺失,導(dǎo)致無法納入本次分析,所以