核酸的物化性質(zhì)

核酸的物化性質(zhì)第1頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、核酸的水解核酸分子中的N-糖苷鍵和磷酸酯鍵都可被水解。（一）核酸的酸解糖苷鍵和磷酸酯鍵都能被酸水解，水解的難易順序?yàn)椋毫姿狨ユI>糖苷鍵嘧啶堿的糖苷鍵>嘌呤堿的糖苷鍵嘌呤與脫氧核糖之間的糖苷鍵最易水解。如，DNA在pH1.6于37℃對(duì)水透析即可完全除去嘌呤堿，。嘧啶糖苷鍵的水解常需要較高的溫度。用甲酸（98％-100%）密封加熱至175℃2h，無(wú)論RNA或DNA都可以完全水解，產(chǎn)生嘌呤和嘧啶堿。第2頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）核酸的堿解常用的堿有NaOH、KOH等，主要水解磷酸酯鍵。以KOH效果最好。RNA較易被堿水解。例如，在0.3-1mol/LNaOH溶液中，在室溫至370C條件下RNA幾乎可以完全水解，生成2′-或3′-核苷酸，還可能有少量的核苷、2′,5′-或3′,5′-核苷二磷酸。DNA在較難被堿水解。DNA在1mol/LNaOH溶液中，加溫至1000C，4個(gè)小時(shí)也可得到小分子的寡聚脫氧核苷酸。這種水解性能上的差別，與RNA核糖基上2′-OH參與作用有很大的關(guān)系。在RNA水解時(shí)，2′-OH首先進(jìn)攻磷酸基，在斷開(kāi)磷酯鍵的同時(shí)形成環(huán)狀磷酸二酯，再在堿的作用形成水解產(chǎn)物。第3頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第4頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（三）核酸的酶解核糖核酸酶T2（RNaseT2）。這個(gè)酶的來(lái)源同RNaseT1，主要作用點(diǎn)為Ap殘基，可以將tRNA完全降解成3′-腺苷酸結(jié)尾的寡核苷酸。第5頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月牛脾核糖核酸酶的作用位點(diǎn)核糖核酸酶T1的作用位點(diǎn)第6頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

鏈球菌脫氧核糖核酸酶，是一個(gè)內(nèi)切酶，作用于DNA產(chǎn)物為5′-磷酸為末端的碎片，其長(zhǎng)度不一。限制性內(nèi)切酶，在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)有這類酶，主要是降解外源的DNA。具有很嚴(yán)格的堿基序列專一性，是基因工程最重要的工具酶。第7頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第8頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第9頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、核酸的紫外吸收在核酸分子中，由于嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵體系，使堿基、核苷、核苷酸和核酸在240-290nm之間有強(qiáng)吸收峰，在260nm左右有最大吸收峰?？梢宰鳛楹怂峒捌浣M分定性和定量測(cè)定的依據(jù)。對(duì)于純的DNA或RNA，可測(cè)定A260

雙螺旋DNA含量（μg/mL）=A26050

單鏈DNA含量（μg/mL）=A26040

寡核苷酸含量（μg/mL）=A26020

純度的判斷：測(cè)定A260/A280的比值，純DNA比值>1.8

純RNA比值≥2.0第10頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月有時(shí)核酸溶液的紫外吸收以摩爾磷的吸光度來(lái)表示，摩爾磷即相當(dāng)于摩爾核苷酸。據(jù)此先測(cè)定核酸溶液中的磷含量及紫外吸收值，然后求出摩爾磷吸光系數(shù)ε（P）。增色效應(yīng)——當(dāng)雙鏈核酸變性轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂満怂釙r(shí)，其在260nm的紫外吸收值增加，ε（P）值也升高，這種現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)。減色效應(yīng)——當(dāng)單鏈核酸復(fù)性轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈核酸時(shí)，其在260nm的紫外吸收值減少，ε（P）值也降低，這種現(xiàn)象稱為減色效應(yīng)。第11頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月四．核酸的變性、復(fù)性與雜交（一）核酸的變性（denaturation）核酸的變性——指核酸雙螺旋區(qū)的堿基之間的氫鍵斷裂，變成單鏈的過(guò)程。能夠引起核酸變性的因素很多。溫度升高、酸堿度改變、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的變性。RNA本身只有局部的雙螺旋區(qū)，所以變性行為所引起的性質(zhì)變化沒(méi)有DNA那樣明顯。利用紫外吸收的變化，可以檢測(cè)核酸變性的情況。因?yàn)樘烊粻顟B(tài)的DNA在完全變性后，紫外吸收(260nm)值增加25－40%.而RNA變性后，約增加1.1%。第12頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月A260值增加粘度下降浮力密度增大分子量不變DNA變性后的表現(xiàn)第13頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月DNA的熱變性和解鏈溫度（Tm）用加熱的方法使核酸變性叫做熱變性。DNA的變性過(guò)程是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。因此，通常把加熱變性使DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時(shí)的溫度稱為DNA熔解溫度或熔點(diǎn)，用Tm

表示。一般DNA的Tm值在82-95

C之間。RNA的Tm值tRNA的Tm值第14頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月DNATm的影響因素：（1）DNA的均一性。均質(zhì)DNA，如一些病毒DNA，人工合成的poly(A-T)、poly(G-C)的熔解過(guò)程發(fā)生在一個(gè)較小的溫度范圍內(nèi)；異質(zhì)DNA的熔解過(guò)程發(fā)生在一個(gè)較寬的溫度范圍內(nèi)。Tm大小可反映出DNA的均一性。第15頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（2）G-C的含量。G-C的含量高，Tm值高。因而測(cè)定Tm值，可反映DNA分子中G、C含量，可通過(guò)經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算：（G+C)%=(Tm-69.3)

2.44第16頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（3）介質(zhì)中的離子強(qiáng)度。Tm與介質(zhì)中離子強(qiáng)度有關(guān)，一般來(lái)說(shuō)，在離子強(qiáng)度低的介質(zhì)中，DNA的Tm值較低，熔解的范圍較寬。在離子強(qiáng)度高的介質(zhì)中，DNA的Tm值較高，熔解的范圍較窄。DNA的保存應(yīng)在含鹽的緩沖液中第17頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月RNA的變性第18頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）核酸的復(fù)性變性DNA在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分開(kāi)的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過(guò)程稱為復(fù)性。DNA復(fù)性后，一系列物理、化學(xué)性質(zhì)將得到恢復(fù)。DNA復(fù)性的程度、速率與復(fù)性過(guò)程的條件有關(guān)。將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時(shí)，DNA不可能復(fù)性。但是將變性的DNA緩慢冷卻時(shí)，可以復(fù)性，這一過(guò)程也叫退火（annealing)。分子量越大復(fù)性越難。濃度越大，復(fù)性越容易。此外，DNA的復(fù)性也與它本身的組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)。復(fù)性反應(yīng)的速度用Cot1/2表示。Co為變性DNA復(fù)性時(shí)的濃度，t為時(shí)間，以秒表示。第19頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月DNA復(fù)性第20頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（三）核酸的雜交（hybridization）熱變性的DNA單鏈，在復(fù)性時(shí)并不一定與同源DNA互補(bǔ)鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，它也可以與在某些區(qū)域有互補(bǔ)序列的異源DNA單鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。這樣形成的新分子稱為雜交DNA分子。DNA單鏈與互補(bǔ)的RNA鏈之間也可以發(fā)生雜交。核酸的雜交在分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的研究中具有重要意義。第21頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第22頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第23頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第24頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第25頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Southernblotting(Southern印跡)Northernblotting(Northern印跡)Westernblotting(Western印跡)第26頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第15章核酸的研究方法一、核酸的分離、提純和定量（一）DNA的分離1、染色體DNA與堿性蛋白（組蛋白）結(jié)合成的核蛋白（DNP）沉淀真核細(xì)胞破碎1mol/L氯化鈉提取稀釋至0.14mol/L加水飽和的苯酚，振蕩冷凍離心水相（含DNA）酚相（含蛋白質(zhì)）加2倍體積冷乙醇純DNA第27頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、用氯仿-辛醇（或異戊醇）代替苯酚，方法同165℃保溫4h真核細(xì)胞懸液加入2倍體積含1%SDS的緩沖液和廣譜蛋白酶加苯酚抽提分離水相（含DNA和少量RNA）酚相（含蛋白質(zhì)和酶）加RNA酶純DNA3、4、氯化銫密度梯度離心第28頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）第29頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（三）第30頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第31頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第32頁(yè)，課件共41頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第33頁(yè)