非洲豬瘟的流行病學(xué)、流行與防治

非洲豬瘟的流行病學(xué)、流行與防治

非洲豬疫情（asf）是由非洲豬疫情病毒（asfv）引起的急性、烈性和高度接觸性傳染病。ASF在1921年于非洲的肯尼亞發(fā)生，其后擴散到非洲各國及歐洲、南美洲。2007年以來，ASF在全球多個國家發(fā)生、擴散、流行，特別是俄羅斯及其周邊地區(qū)。該病早期發(fā)現(xiàn)難、防控難、根除難，被稱作養(yǎng)豬業(yè)的頭號殺手，我國將其列為一類動物疫病，也是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定的法定報告動物疫病。自從2018年ASF傳入我國后，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的損失。ASFV屬于非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬成員，只有1個血清型，可分為24個基因型1材料和方法1.1病毒的血樣、發(fā)酵非洲豬瘟病毒Ⅱ型(ASFVⅡ型)基因組DNA,濃度0.73×10非洲豬瘟病毒株來自廣東省動物衛(wèi)生監(jiān)督所，是廣州華醫(yī)測檢測科技有限公司2019年5月份參加廣東省非洲豬瘟能力驗證所留存樣品，編號分別為A32、A193、A51、A99、A174,為含滅活病毒的血樣。豬瘟活疫苗，購自廣東永順生物制藥有限公司；豬傳染性胃腸炎滅活疫苗、豬流行性腹瀉滅活疫苗，購自武漢科前生物股份有限公司；豬肺炎支原體活疫苗，購自齊魯動物保健品有限公司；口蹄疫滅活疫苗，購自天康生物有限公司；豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗和豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗，購自中牧實業(yè)股份有限公司。MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5.0,購自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、快速質(zhì)粒小提試劑盒，購自天根生物科技有限公司；PEASY-T1SimpleCloningKit,購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；熒光定量PCR儀(StepOnePlus),賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)(Tanon1600)、電泳儀(EPS300),上海天能科技有限公司產(chǎn)品。1.2方法1.2.1豬肺炎產(chǎn)物的核酸提取采用MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5.0,按照說明書進行操作，分別提取非洲豬瘟病毒(滅活)、豬瘟病毒(CSFV)、口蹄疫病毒(FMDV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬肺炎支原體的核酸，主要的提取過程是：取200μL樣品，加入200μL的bufferVGB、20μL的ProteinaseK和1.0μL的CarrierRNA,充分混勻，于56℃水浴溫浴10min。向裂解液中加入200μL無水乙醇，充分吸打混勻。將SpinColumn安置于CollectionTube上，溶液移至SpinColumn中，12000r/min離心2min,棄濾液。將500μL的bufferRWA加入SpinColumn中，12000r/min離心1min,棄濾液。將700μL的bufferRWB加入SpinColumn中，12000r/min離心1min,棄濾液。重復(fù)上一步驟。將SpinColumn安置于CollectionTube上，12000r/min離心2min。將SpinColumn安置于新的1.5mLRNasefreecollectiontube上，在SpinColumn膜的中央處加入30μL～50μL的RNasefreedH1.2.2n/hlj/2018根據(jù)非洲豬瘟病毒流行毒株P(guān)ig/CN/HLJ/2018(GenBank:MK333180.1)分別設(shè)計B646L(P72)和EP402R(1.2.3反應(yīng)體系及程序以p72-F、p72-R上、下游引物擴增，按照以CD2v-F、CD2v-R上、下游引物擴增ASFVCD2v基因，反應(yīng)體系如上。反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃4min;變性94℃30s,退火50℃30s,延伸72℃30s,35個循環(huán)；72℃延伸10min。將擴增目的片段與PEASY-T1載體連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性重組克隆，由上海生工生物工程有限公司測序鑒定。將正確插入陽性質(zhì)?？截悢?shù)的計算公式為：(6.02×101.2.42-定量實時熒光pcr檢測方法的建立1.2.4.單次廣泛化煌pcr反應(yīng)條件的優(yōu)化用濃度為5.02×101.2.4.2cd2v單次熒光定量pcr反應(yīng)條件的優(yōu)化用濃度為7.7×101.2.4.p372-cd2v雙重?zé)晒舛縫cr反應(yīng)條件的優(yōu)化以濃度為5.02×101.2.4.標(biāo)準(zhǔn)曲線的配置分別對T1-p72和T1-CD2v陽性質(zhì)粒進行10倍系列稀釋，使其濃度范圍分別為5.02×101.2.4.5.最低檢測限制對非洲豬瘟病毒(ASFVⅡ型)基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行10倍倍比稀釋，使其濃度為0.73×101.2.4.6年和特異性分別選取3個濃度的T1-p72陽性質(zhì)粒(5.02×101.2.4.陰性樣品測定檢測2017年以前保存的105份來自國內(nèi)豬場的血清和組織樣本，2019年5月留存的非洲豬瘟病毒(滅活)參考樣品5份，其中A32和A193為陰性，A51、A99、A174為陽性。上述樣品經(jīng)常規(guī)處理后，采用MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5.0試劑盒，按操作說明書提取樣品RNA/DNA,用建立的雙重?zé)晒舛縋CR方法進行檢測。2結(jié)果2.1pcr擴增asfv核酸分別以p72-F、p72-R上、下游引物，CD2v-F、CD2v-R上、下游引物擴增ASFV核酸，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，p72在160bp處有明顯條帶、CD2v在144bp處有明顯條帶(圖1)。測序后，T1-p72、T1-CD2v的插入片段用DANSTAR軟件與Pig/CN/HLJ/2018進行序列比對，同源性為100%。2.2p72基因熒光定量pcr反應(yīng)條件的優(yōu)化用濃度為5.02×102.3c-2v基因熒光定量pcr反應(yīng)條件的優(yōu)化用濃度為7.7×102.4p72和cd2v基因的雙熒光定量pcr反應(yīng)條件的優(yōu)化以濃度為5.02×102.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建對T1-p72陽性質(zhì)粒、T1-CD2v陽性質(zhì)粒進行10倍倍比稀釋，使其濃度范圍分別5.02×10copies/μL～5.02×102.6最小檢測線限非洲豬瘟病毒(ASFVⅡ型)基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10倍倍比稀釋后的濃度為0.73×102.7重復(fù)試驗分別選取3個濃度的T1-p72陽性質(zhì)粒(5.02×102.8疫苗核酸檢測以豬瘟疫苗、口蹄疫疫苗、豬圓環(huán)病毒2型疫苗、豬繁殖與呼吸綜合征疫苗、豬傳染性胃腸炎疫苗、豬支原體疫苗和豬流行性腹瀉疫苗的核酸為模板，按優(yōu)化后雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)條件進行檢測。結(jié)果顯示，僅陽性對照T1-p72和T1-CD2v有特異性擴增曲線，CSFV、FMDV、PCV2、PRRSV、PEDV、TGEV、豬肺炎支原體均無特異性擴增。2.9非洲豬景觀檢測結(jié)果檢測2017年以前保存的105份來自國內(nèi)豬場的血清和組織樣本，結(jié)果顯示，105份樣品均無非洲豬瘟病毒擴增。檢測2019年5月留存的非洲豬瘟滅活樣品5份，其中A32和A193為陰性，A51、A99、A174為陽性。國內(nèi)非洲豬瘟疫情首次暴發(fā)于2018年8月，因此105份的檢測結(jié)果與實際相符。5份留存的非洲豬瘟滅活樣品的檢測結(jié)果與廣東省動物衛(wèi)生監(jiān)督所的結(jié)果一致。3實時熒光定量pcr在非洲豬蚤體內(nèi)的應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)(real-timePCR)從1995發(fā)展至今，其高通量、快速、準(zhǔn)確、靈敏的特點使其廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)檢驗、動植物檢疫以及食品安全等。實時熒光定量PCR被認(rèn)為是ASFV檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。目前對非洲豬瘟野毒的鑒定主要是針對本文建立的雙重?zé)晒舛縋CR可在1個反應(yīng)管內(nèi)同時檢測ASFVp72和CD2v基因。同時檢測ASFVp7