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文檔簡(jiǎn)介
染色體微陣列技術(shù)原理
與臨床應(yīng)用染色體微陣列技術(shù)原理
與臨床應(yīng)用1一.出生缺陷概念及概況二.遺傳病常見診斷方法及比較三.染色體微陣列技術(shù)臨床應(yīng)用四.病例分享五.染色體微陣列技術(shù)局限性、結(jié)果判讀及帶來的挑戰(zhàn)一.出生缺陷概念及概況2一.出生缺陷概念及概況一.出生缺陷概念及概況3出生缺陷也稱先天異常,是指由于遺傳因素、環(huán)境因素或兩者共同作用于孕前或孕期,引起胚胎或胎兒在發(fā)育過程中發(fā)生解剖學(xué)結(jié)構(gòu)和/或功能上的異常。2012年衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)我國(guó)出生缺陷率達(dá)5.6%,每年新增出生缺陷患兒90-120萬例。隨著二胎政策的全面放開,孕婦年齡增加及環(huán)境因素影響,估計(jì)出生缺陷數(shù)量還會(huì)增加。保守估計(jì),我國(guó)有上千萬的罕見病群體,幾乎無法得到有效診斷和治療,甚至遭到嚴(yán)重歧視。出生缺陷也稱先天異常,是指由于遺傳因素、環(huán)境因素或兩者共同作4出生缺陷出生缺陷遺傳因素環(huán)境因素(理、化、生物因素、生活方式)遺傳+環(huán)境因素染色體異常(所有新生兒中,染色體異常占0.92%,多為新發(fā)而非遺傳)單基因突變(多為孟德爾遺傳,少數(shù)為新發(fā))出生缺陷出生缺陷遺傳因素環(huán)境因素(理、化、生物因素、生活方式5基因組:細(xì)胞核DNA成分和線粒體DNA分子的總和基因:基因組內(nèi)一個(gè)個(gè)具體的結(jié)構(gòu)和功能單位染色體:基因的載體細(xì)胞核DNA:46條染色體,30億個(gè)堿基,編碼21000個(gè)基因。線粒體DNA:雙鏈閉合環(huán)狀分子,16569個(gè)堿基,編碼37個(gè)基因,編碼2種rRNA、22種tRNA和13種氧化磷酸化相關(guān)蛋白?;蚪M:細(xì)胞核DNA成分和線粒體DNA分子的總和6染色體微陣列的原理與臨床應(yīng)用--課件7染色體微陣列的原理與臨床應(yīng)用--課件8染色體微陣列的原理與臨床應(yīng)用--課件9Progeriasyndrome
ApointmutationoftheLMNAgenelongevityMorethan150genespreventscholesterolbuildupProgeriasyndromelongevity10
精確控制胚胎發(fā)育和分化的每一個(gè)步驟;決定了個(gè)體的所有生命特征;決定了個(gè)體患各種疾病的可能性.精確控制胚胎發(fā)育和分化的每一個(gè)步驟;11遺傳?。哼z傳物質(zhì)發(fā)生突變所引起的疾病。種類:確定的遺傳疾病超過7000種。1、單基因病--涉及一對(duì)基因,AR、AD、XR、XD、Y連鎖遺傳病。隱性遺傳4000,顯性遺傳3000。
2、多基因病--多對(duì)基因和環(huán)境共同作用所導(dǎo)致的疾病。
3、染色體病--數(shù)目異常及結(jié)構(gòu)異常引起的疾病。4、體細(xì)胞遺傳病--體細(xì)胞突變?nèi)缒[瘤。5、線粒體病--線粒體功能異常為主要起因的一大類疾病。特征:垂直傳遞、終生性、發(fā)病率低、危害嚴(yán)重、家族性發(fā)病、多無有效治療。成為危害人類健康的主要疾病。遺傳病:遺傳物質(zhì)發(fā)生突變所引起的疾病。12Genetic/GenomicDisordersGenomicdisorders(number)Trisomy21Trisomy18Trisomy13MosaictrisomiesofotherchromosomesGenomicdisorders(structure)Morethan400knowndisordersMonogenicdisordersDominant(4,000)Recessive(3,000)MultigenicdisordersGenes+EnvironmentsGenetic/GenomicDisordersGenom13二.遺傳病常見診斷方法及比較二.遺傳病常見診斷方法及比較14遺傳病的診斷染色體核型分析Karyotyping熒光原位雜交
FluorescenceInSituHybridization(FISH)染色體微陣列技術(shù)Chromosomalmicroarrayanalysis(CMA)
測(cè)序技術(shù)First-generation-SangermethodNovelsequencingtechniques遺傳病的診斷15傳統(tǒng)核型分析技術(shù)除了染色體非整倍體,染色體微缺失和微重復(fù)等基因組失衡是導(dǎo)致胎兒發(fā)育遲緩、畸形和其他先天性疾病的主要原因。Structuralvariationinthehumangenomeanditsroleindisease[J].AnnuRevMed.2010,61:437-55傳統(tǒng)核型分析技術(shù)除了染色體非整倍體,染色體微缺失和微重復(fù)等基16染色體微陣列的原理與臨床應(yīng)用--課件17是目前較為成熟的遺傳性疾病診斷技術(shù)傳統(tǒng)核型分析技術(shù)絨毛活檢取材孕中期羊膜腔穿刺羊水細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析染色體數(shù)量變化、平衡、不平衡易位、轉(zhuǎn)位和顯微鏡下可見的大片段缺失和重復(fù)。
是目前較為成熟的遺傳性疾病診斷技術(shù)傳統(tǒng)核型分析技術(shù)絨毛活檢取18核型分析局限性材料受限,需要新鮮的組織、血樣進(jìn)行活細(xì)胞培養(yǎng)不能分辨長(zhǎng)度在10Mb以下染色體片斷的缺失、重復(fù)或易位染色體亞端粒區(qū)域異常診斷率較低不能檢測(cè)LOH和UPD單細(xì)胞分析
高分辨率分析核型分析局限性單細(xì)胞分析19熒光原位雜交技術(shù)(fluorescentin-situhybridization,F(xiàn)ISH)可對(duì)相應(yīng)位點(diǎn)的缺失、重復(fù)、易位及多倍體等染色體異常作出診斷提高了染色體異常的診斷精度FISH探針能同時(shí)與分裂期染色體或間期核染色絲特異雜交----無需細(xì)胞培養(yǎng),可用于單細(xì)胞分析Chromosome13q13-14熒光標(biāo)記的DNA探針中期分裂相間期細(xì)胞核Chromosome21q21熒光原位雜交技術(shù)(fluorescentin-situh20FISH局限性只能檢測(cè)已知突變的疾病,對(duì)背景未知的基因引發(fā)的疾病無法檢測(cè)。不能分辨LOH和UPD一次最多只能檢測(cè)5-8個(gè)位點(diǎn),無法進(jìn)行整個(gè)基因組的檢測(cè),增加探針又會(huì)面臨準(zhǔn)確性下降的問題。對(duì)植入前胚胎的檢測(cè),缺乏覆蓋全基因組檢測(cè)的能力FISH局限性只能檢測(cè)已知突變的疾病,對(duì)背景未知的基因引發(fā)的21染色體微陣列技術(shù)(chromosomalmicroarrayanalysis)微陣列比較基因組雜交(arraycomparativegenomichybridization,aCGH)SNParray染色體微陣列技術(shù)(chromosomalmicroarra22微陣列比較基因組雜交技術(shù)
(arraycomparativegenomichybridization,aCGH)
aCGH技術(shù)圖示:正常對(duì)照樣品和患者樣品基因組DNA用兩種不同的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記(正常樣品用Cy3標(biāo)記呈現(xiàn)綠色,患者樣品用Cy5標(biāo)記呈現(xiàn)紅色)。綠色峰(Cy3)表明紅色信號(hào)缺失,與對(duì)照樣品相比患者DNA樣品發(fā)生缺失。相反如果Cy5信號(hào)增強(qiáng)顯示為紅色峰(紅色箭頭),表明患者DNA樣品特定基因組區(qū)域發(fā)生獲得。aCGH芯片能夠定位DNA拷貝數(shù)量變化在基因組的位置。微陣列比較基因組雜交技術(shù)
(arraycomparativ23SNP芯片含有大量寡核苷酸探針,起初設(shè)計(jì)被用于檢測(cè)SNP等位基因。SNP芯片不僅能夠研究拷貝數(shù)變異(CNV),而且還能夠?qū)NP基因型進(jìn)行分析SNParraySNP芯片含有大量寡核苷酸探針,起初設(shè)計(jì)被用于檢測(cè)SNP等位24染色體微陣列(chromosomalmicroarrayanalysis,CMA)技術(shù)優(yōu)勢(shì)全基因組范圍內(nèi)同時(shí)檢測(cè)染色體數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常如染色體微缺失(deletion)和微重復(fù)(duplication),并能較準(zhǔn)確的測(cè)定其大小,并精確定位。不需要細(xì)胞培養(yǎng),可直接檢測(cè)血液、羊水(amnioticfluid,AF)和絨毛膜絨毛(chorionicvillussampling,CVS)樣本,出報(bào)告速度更快,結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。檢測(cè)≥10%水平的嵌合體鑒定雜合子缺失LOH和單親二倍體(uniparentaldisomy,UPD),親緣關(guān)系的分析。分辨率高:30Kb結(jié)合全基因擴(kuò)增技術(shù),可以進(jìn)行胚胎全染色體組的檢測(cè)------PGS/PGD染色體微陣列(chromosomalmicroarray25染色體微陣列的原理與臨床應(yīng)用--課件26染色體芯片與傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)比較染色體芯片與傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)比較27染色體微缺失和微重復(fù)綜合征概念:染色體微陣列技術(shù)(chromosomalmicroarrayanalysis,CMA)和熒光原位雜交技術(shù)(florescenceinsituhybridization,F(xiàn)ISH)的應(yīng)用,使許多用傳統(tǒng)染色體核型分析難以識(shí)別的染色體綜合征得以發(fā)現(xiàn)。這些綜合征缺失和重復(fù)的大小多在幾百Kb到幾兆堿基對(duì)。與單基因病不同,其癥狀受多基因影響,因而又稱連續(xù)性基因缺失或重復(fù)綜合征(contiguousgenedeletionorduplicationsyndrome)。大部分綜合征不能被染色體核型分析所識(shí)別,因而成為微缺失和微重復(fù)綜合征(microdeletionandmicroduplicationsyndrome)。
染色體微缺失和微重復(fù)綜合征28拷貝數(shù)變異(copynumbervariants,CNVs):
指大于1kb染色體變異(基因組變異),包括核型分析檢測(cè)不到的基因組微缺失和微重復(fù),被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于人類基因組中。已有大量研究證實(shí)CNVs與許多疾病相關(guān),包括數(shù)百種染色體微缺失、微重復(fù)綜合征,是先天畸形和神經(jīng)發(fā)育障礙的主要遺傳病因,包括智力低下(mentalretardation,MR),自閉癥(autism),精神分裂癥(Schizophrenia)等??截悢?shù)變異(copynumbervariants,CN29三、染色體微陣列技術(shù)
臨床應(yīng)用三、染色體微陣列技術(shù)臨床應(yīng)用30出生缺陷干預(yù)----關(guān)注生殖全程染色體異常產(chǎn)前診斷孕前診斷精子產(chǎn)后先天性疾病診斷卵子+胚胎胎兒新生兒、兒童早期診斷早期干預(yù)改善預(yù)后夫妻雙方檢測(cè)正常再次生育再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)低致病片段攜帶再次生育再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高出生缺陷干預(yù)----關(guān)注生殖全程染色體異常產(chǎn)前診斷孕前診斷精31染色體微陣列技術(shù)臨床應(yīng)用植入前遺傳病篩查和植入前遺傳病診斷(PGD/PGS)產(chǎn)前診斷產(chǎn)后遺傳病診斷反復(fù)習(xí)慣性自然流產(chǎn)病因分析染色體微陣列技術(shù)臨床應(yīng)用32對(duì)植入前胚胎或卵裂球作染色體和/或基因?qū)W檢測(cè),將無疾病胚胎植入子宮妊娠,并出生正常子代的技術(shù)輔助生殖與遺傳學(xué)技術(shù)相結(jié)合的一種產(chǎn)前診斷方法關(guān)鍵點(diǎn)是建立單細(xì)胞遺傳診斷技術(shù)孕前診斷-----植入前遺傳學(xué)診斷技術(shù)
(preimplantationGeneticDiagnosis,PGD)對(duì)植入前胚胎或卵裂球作染色體和/或基因?qū)W檢測(cè),將無疾病胚胎植33高齡產(chǎn)婦反復(fù)體外受精失敗反復(fù)流產(chǎn)嚴(yán)重的男性不育癥父母為平衡易位、倒位攜帶者非整倍體是輔助生殖低妊娠率和高流產(chǎn)率的主要因素,PGS的目的是識(shí)別整倍體的正常胚胎轉(zhuǎn)移,以實(shí)現(xiàn)增加懷孕的機(jī)會(huì)CMA植入前胚胎遺傳學(xué)篩查/診斷適應(yīng)人群1in10couples高齡產(chǎn)婦CMA植入前胚胎遺傳學(xué)篩查/診斷適應(yīng)人群1in134染色體微陣列的原理與臨床應(yīng)用--課件35CMA產(chǎn)前診斷適應(yīng)人群父母為平衡易位攜帶者胎兒B超檢查發(fā)現(xiàn)異常羊水染色體核型分析已發(fā)現(xiàn)異常,但無法確定異常染色體的確切位置或來源胎兒發(fā)現(xiàn)新發(fā)的染色體相互易位,需進(jìn)一步排除微缺失和微重復(fù)希望更全面、更準(zhǔn)確的了解胎兒染色體情況,以排除出生缺陷的可能性(生長(zhǎng)發(fā)育遲緩,智力低下、自閉癥等原因)產(chǎn)前診斷CMA產(chǎn)前診斷適應(yīng)人群父母為平衡易位攜帶者產(chǎn)前診斷36產(chǎn)前診斷產(chǎn)前診斷37用于檢測(cè)CNV的染色體芯片(CMA)在下列情況應(yīng)作為一線檢測(cè)手段非已知綜合癥的多發(fā)畸形非綜合癥型的發(fā)育遲緩/智力低下孤獨(dú)癥譜系疾病進(jìn)一步明確發(fā)育遲緩、語言發(fā)育落后和其他尚不明確遺傳學(xué)病因的癥狀對(duì)于一些CMA檢出不平衡的病例,建議用細(xì)胞遺傳/FISH進(jìn)行確認(rèn),同時(shí)對(duì)父母進(jìn)行臨床遺傳評(píng)估和咨詢產(chǎn)后出生缺陷患兒遺傳病診斷用于檢測(cè)CNV的染色體芯片(CMA)在下列情況應(yīng)作為一線檢測(cè)38TheAmericanJournalofHumanGenetics86,749–764,May14,2010發(fā)育障礙和智力低下等先天缺陷疾病首選CMA產(chǎn)后出生缺陷患兒遺傳病診斷21698例不明原因發(fā)育遲緩、低智,孤獨(dú)癥,多發(fā)畸形芯片(CMA)檢測(cè):診斷率15%-20%核型分析:診斷率僅3%
TheAmericanJournalofHuman39金域檢驗(yàn)(2013-2016):4750例,26.3%截止2016年5月,金域檢驗(yàn)已采用CMA檢測(cè)出生缺陷/遺傳病病例4750例,其中陽性病例1249例,檢出陽性率達(dá)26.3%患者臨床表型智力低下、發(fā)育遲緩、多發(fā)畸形、自閉癥金域檢驗(yàn)(2013-2016):4750例,26.3%截止240染色體微陣列的原理與臨床應(yīng)用--課件41患者臨床表型解析智力低下、發(fā)育遲緩、多發(fā)畸形等為CMA主要適應(yīng)癥;合并不同臨床表型病例,CMA診斷陽性率較高;患者臨床表型解析智力低下、發(fā)育遲緩、多發(fā)畸形等為CMA主要適42CMA檢出CNV類型分析CMA可檢出微缺失/微重復(fù)、單親二倍體、非整倍體、嵌合體等多種CNV類型CNV片段大于5MB(核型分析檢測(cè)下限):理想情況下核型檢出率為4.95%,遠(yuǎn)低于CMA26.1%的檢出率。CMA檢出CNV類型分析CMA可檢出微缺失/微重復(fù)、單親二倍43檢出微缺失/微重復(fù)綜合征舉例檢出微缺失/微重復(fù)綜合征舉例44微缺失/微重復(fù)類型檢測(cè)出最常見染色體522例陽性樣本中所檢測(cè)出的UPD類型及疾病相關(guān)性微缺失/微重復(fù)類型522例陽性樣本中所檢測(cè)出的UPD類型及疾45患者雙親評(píng)估十分必要為降低患者父母再生育風(fēng)險(xiǎn),對(duì)于患者父母進(jìn)行相關(guān)檢測(cè),可有效指導(dǎo)其再次生育。由于CMA不能檢測(cè)染色體平衡易位,故核型分析和FISH技術(shù)在某些特定情況下仍具有優(yōu)勢(shì)。部分染色體微缺失/微重復(fù)陽性樣本按其遺傳方式分類患者雙親評(píng)估十分必要為降低患者父母再生育風(fēng)險(xiǎn),對(duì)于患者父母進(jìn)46小結(jié)CMA對(duì)于智力低下、發(fā)育遲緩、多發(fā)畸形等多種臨床異??捎行г\斷,明顯優(yōu)于染色體核型分析,可取代其作為遺傳病診斷的一線檢測(cè)手段;對(duì)于患者雙親后續(xù)遺傳學(xué)檢測(cè)及分析,要選擇合適的方法學(xué),做好遺傳咨詢工作,對(duì)再次生育做指導(dǎo)。小結(jié)CMA對(duì)于智力低下、發(fā)育遲緩、多發(fā)畸形等多種臨床異47染色體微陣列的原理與臨床應(yīng)用--課件48染色體異常是導(dǎo)致流產(chǎn)的重要病因
約10%~15%妊娠會(huì)發(fā)生自然流產(chǎn),其中絕大多數(shù)發(fā)生在孕早期,且50%左右是由于染色體異常所致。包括染色體數(shù)目異常占86%(包括非整倍體和多倍體),結(jié)構(gòu)異常(染色體缺失和/或重復(fù))占6%,嵌合體占8%。(以往文獻(xiàn)報(bào)道)染色體芯片對(duì)流產(chǎn)物檢測(cè)染色體異常是導(dǎo)致流產(chǎn)的重要病因染色體芯片對(duì)流產(chǎn)物檢測(cè)49目前流產(chǎn)物檢測(cè)常用手段為核型分析與熒光原位雜交(fluorescentinsituhybridization,FISH)。核型分析:5Mb以上遺傳物質(zhì)改變,無法對(duì)許多具有致病性的染色體亞顯微結(jié)構(gòu)的變異--染色體微缺失/微重復(fù)做出檢測(cè)。此外需對(duì)絨毛組織進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),耗時(shí)較長(zhǎng),且容易污染。一些活性差的細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制,或者母體細(xì)胞過度生長(zhǎng),這都會(huì)導(dǎo)致得不到準(zhǔn)確核型。而臨床上部分流產(chǎn)物已不具有細(xì)胞活性,導(dǎo)致培養(yǎng)失敗。FISH檢測(cè):可避免細(xì)胞培養(yǎng),然而僅能對(duì)特異染色體數(shù)目異常進(jìn)行篩查,常用探針為13、16、18、21、22、X、Y探針,無法對(duì)與特異探針結(jié)合的其它染色體數(shù)目異常進(jìn)行檢測(cè),因此存在假陰性的可能。CMA:可在全基因組范圍內(nèi)同時(shí)檢測(cè)染色體數(shù)目異常和染色體微缺失、微重復(fù)等結(jié)構(gòu)異常、嵌合體和ROHs等,無需細(xì)胞培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)周期短,結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠目前流產(chǎn)物檢測(cè)常用手段為核型分析與熒光原位雜交(fluor50染色體微陣列的原理與臨床應(yīng)用--課件51非整倍體中16三體所占比例最高(20.5%),且均在孕早期流產(chǎn)。其次為Turner綜合征(14.5%),流產(chǎn)可發(fā)生孕期各階段。絕大多數(shù)染色體非整倍體為新生突變,而D組(13,14,15)和G組(21,22)有發(fā)生羅伯遜易位的可能,建議夫妻雙方做核型分析,排除羅伯遜易位的可能性。孕婦年齡為發(fā)生染色體數(shù)目異常高危因素,而本文小于35歲發(fā)生染色體數(shù)目異常導(dǎo)致流產(chǎn)占24.6%由于染色體結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致流產(chǎn)81.25%為反復(fù)習(xí)慣性流產(chǎn),提示
夫妻雙方是平衡易位(75%),建議再次生育做PGD。染色體內(nèi)部微缺失/微重復(fù)例如DiGeorge、Williams、Beckwith-Wiedemann等綜合征流產(chǎn)發(fā)生在孕晚期,核型分析
無法檢測(cè)。UPD非整倍體中16三體所占比例最高(20.5%),且均在孕早期流52小結(jié)CMA能夠提供快速、準(zhǔn)確的流產(chǎn)物全基因組分析,能夠檢測(cè)染色體數(shù)目異常、結(jié)構(gòu)異常、嵌合體和ROHs等,且無需標(biāo)本培養(yǎng),能提供比傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)更多的遺傳信息,可為流產(chǎn)病因分析和對(duì)夫妻雙方再次生育指導(dǎo)提供更有價(jià)值的信息。指導(dǎo)下一次妊娠減輕患者不必要的心理負(fù)擔(dān)。小結(jié)53檢測(cè)標(biāo)本活檢的單個(gè)卵裂球絨毛引產(chǎn)胎兒組織羊水臍血外周血檢測(cè)標(biāo)本活檢的單個(gè)卵裂球54四.病例分享四.病例分享55染色體微陣列的原理與臨床應(yīng)用--課件56AssociationofCNVwithobesityAssociationofCNVwithobesit57AssociationofCNVwithobesityAssociationofCNVwithobesit58AssociationofCNVwithepilepsyAssociationofCNVwithepilep59染色體微陣列的原理與臨床應(yīng)用--課件60癲癇神經(jīng)、精神系統(tǒng)疾病,例如ADHD,精神分裂癥肥胖、矮小先天性心臟病過度生長(zhǎng)綜合征CMA出生缺陷檢測(cè)適應(yīng)癥智力低下生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)、語言發(fā)育遲緩多發(fā)畸形自閉癥譜系疾病主要適應(yīng)癥拓展適應(yīng)癥癲癇CMA出生缺陷檢測(cè)適應(yīng)癥智力低下主要適應(yīng)癥拓展適應(yīng)癥61出生缺陷患兒檢測(cè)流程出生缺陷患兒檢測(cè)流程6263GenotypefirstvsPhenotypefirstWholegenomescreeningvsCandidateapproachGrafWD,LePichonJB,BittelDC,AbdelmoityAT,andYuS.Practiceparameter:evaluationofthechildwithmicrocephaly(anevidence-basedreview):reportofthequalitystandardssubcommitteeoftheAmericanAcademyofNeurologyandthePracticeCommitteeoftheChildNeurologySociety.Neurology.2010;74(13):1080-1.LedbetterDH.Cytogenetictechnology--genotypeandphenotype.NEnglJMed.2008;359(16):1728-30.BejjaniBAandShafferLG.Clinicalutilityofcontemporarymolecularcytogenetics.AnnuRevGenomicsHumGenet.2008;9:71-86.63Genotypefirstv
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