補(bǔ)骨脂多成分藥代動(dòng)力學(xué)研究方法的建立及應(yīng)用

補(bǔ)骨脂多成分藥代動(dòng)力學(xué)研究方法的建立及應(yīng)用

補(bǔ)骨脂又名破歲紙（藥理學(xué)）、胡韭菜子（南方記）、胡家鄉(xiāng)子（中藥志）等。中藥藥代動(dòng)力學(xué)在中藥現(xiàn)代化研究鏈條上發(fā)揮著“橋梁學(xué)科”的作用，在中藥體內(nèi)多組分物質(zhì)基礎(chǔ)、多靶點(diǎn)作用的藥效和安全性等關(guān)鍵科學(xué)問題研究中均起著重要作用材料表面化合物結(jié)構(gòu)鑒定補(bǔ)骨脂藥材購于北京同仁堂藥店。對照品補(bǔ)骨脂素(批號16051324)和異補(bǔ)骨脂素(批號16051721)購自上海同田生物技術(shù)股份有限公司；補(bǔ)骨脂苷(批號B-006-170426)和異補(bǔ)骨脂苷(批號Y-008-170408)購自成都克洛瑪生物科技有限公司；內(nèi)標(biāo)濱蒿內(nèi)酯(批號120-08-1)購自成都克洛瑪生物科技有限公司。以上化合物的純度均大于98%。質(zhì)譜純乙腈購自霍尼韋爾公司；質(zhì)譜純甲酸購自ROEScientificInc.(Newark,USA);超純水為Milli-Q純化系統(tǒng)自制(美國Millipore公司);分析物和內(nèi)標(biāo)的結(jié)構(gòu)見圖1。儀器液相-質(zhì)譜聯(lián)用分析系統(tǒng)(LC-MS/MS)由美國Waters公司生產(chǎn)的Acquity質(zhì)譜檢測條件化合物色譜分離采用WatersHSS-T3色譜柱(2.1mm×100mm,1.8μm);流動(dòng)相均含0.004%甲酸的水和乙腈混合體系，其中A相為水-乙腈(99∶1),B相為水-乙腈(1∶99),梯度洗脫(0～2.5min,10%～20%B;2.5～2.6min,20%～40%B;2.6～6.0min,40%～65%B;6.0～7.0min,100%B;7.0～8.5min,10%B);柱溫40℃,流速0.3mL·min質(zhì)譜檢測選用電噴霧離子源(ESI),源參數(shù)為：噴霧電壓5500V;輔助氣1(GS1)50psi(1psi≈6.895kPa);輔助氣2(GS2)50psi;輔助氣加熱溫度(TEM)500℃;氣簾氣(CUR)35psi;碰撞氣(CAD)Medium。采用正離子多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷和內(nèi)標(biāo)濱蒿內(nèi)酯的檢測離子對分別為187.2→131.1、187.1→131.2、384.2→205.1、384.1→205.2、207.0→151.1,解簇電壓分別為115、115、50、50、60V,碰撞能量分別為35、35、15、15、33eV。鑒定scxk京科技戰(zhàn)略規(guī)劃Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量180～220g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號SCXK(京)2016-0006。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所動(dòng)物房，使用許可證號SYXK(京)2019-0003,飼養(yǎng)條件為室溫(22±2)℃,相對濕度40%～70%,12h光照黑暗循環(huán)，正常飲食飲水，在此環(huán)境下適用1周，給藥前禁食12h以上。方法和結(jié)果樣品的制備和質(zhì)量控制分別精密稱定補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷和內(nèi)標(biāo)濱蒿內(nèi)酯，用乙腈溶解至1mg·mL殘余渣的制備稱取補(bǔ)骨脂100g,加入10倍純水浸泡30min,煮沸2h,紗布濾過，剩余殘?jiān)偌?倍量水煎煮1h,濾過，合并2次濾液，混勻，減壓濃縮至每1mL含生藥2g,-20℃冰箱保存，備用。補(bǔ)骨脂提取液中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為391、288、22800、12000μg·g樣品前處理取體積為50μL的-70℃凍存的大鼠血漿樣品，室溫下放置，使其自然解凍后，加入10μL濱蒿內(nèi)酯(15ng·mL方法學(xué)的檢驗(yàn)特異性取大鼠空白血漿、加入化合物對照溶液的血漿、給藥補(bǔ)骨脂提取物后15min的大鼠血漿，按線性關(guān)系和定量限取空白大鼠血漿45μL,加入不同濃度的5μL工作液后，2000r·min準(zhǔn)確度和精度用低、中、高濃度質(zhì)控樣品進(jìn)行批內(nèi)與批間的準(zhǔn)確度、精密度考察(補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素1、13.5、291.6ng·mL回收率的測定因?yàn)橘|(zhì)譜檢測存在的基質(zhì)效應(yīng)，會影響到常規(guī)的回收率的確定，因此按照如下所述進(jìn)行考察。應(yīng)用空白血漿加入待分析化合物之后進(jìn)行前處理的樣品與空白血漿進(jìn)行前處理再加入待分析化合物之后同濃度樣品的待分析化合物的峰面積比值考察方法的回收率；應(yīng)用空白血漿進(jìn)行前處理再加入待分析化合物之后樣品與乙腈-水(20∶80)復(fù)融溶液配制的同濃度樣品的待分析化合物的峰面積比值考察基質(zhì)效應(yīng)?；厥章逝c基質(zhì)效應(yīng)均考察各化合物3個(gè)質(zhì)控濃度，每濃度質(zhì)控樣品6個(gè)重復(fù)樣。4個(gè)化合物回收率在88.65%～106.4%,基質(zhì)效應(yīng)在88.87%～101.5%,見表2。凍融循環(huán)溶液考察低、中、高濃度質(zhì)控樣品在不同工作條件下的穩(wěn)定性：室溫下放置4h、進(jìn)樣盤6℃放置24h、-70℃-室溫凍融循環(huán)3次、-70℃冰箱中放置30d。穩(wěn)定性樣品中化合物濃度偏離標(biāo)示濃度(bias)不超過15.0%,穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表3。藥動(dòng)學(xué)分析及數(shù)據(jù)處理SD大鼠20只，雌性各半，分為2組，分別為單次給藥組和連續(xù)7d多次給藥組。補(bǔ)骨脂水提液給藥劑量為6g·kg用建立的分析方法對大鼠血漿樣品進(jìn)行分析，所得的各化合物不同時(shí)間點(diǎn)的濃度數(shù)據(jù)用Phoenix?WinNonlin?7.0軟件(美國)非房室模型分析處理，計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。應(yīng)用MicrosoftExcel處理數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差大鼠單次灌胃給藥補(bǔ)骨脂提取物后，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的平均達(dá)峰時(shí)間(大鼠連續(xù)7d灌胃給藥，末次給藥補(bǔ)骨脂提取物后，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的平均達(dá)峰時(shí)間(補(bǔ)骨脂提取物的藥代動(dòng)力學(xué)特征本研究建立了同時(shí)測定大鼠血漿中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷4個(gè)活性成分的UPLC-MS/MS分析方法，應(yīng)用該方法研究了單次和多次給藥補(bǔ)骨脂提取物后大鼠體內(nèi)補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂苷及異補(bǔ)骨脂苷的藥代動(dòng)力學(xué)特征。研究結(jié)果表明，雖然提取物中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含