白消安對sd大鼠少精子癥動物模型的建立

白消安對sd大鼠少精子癥動物模型的建立

小動物器官模型及無精子癥模型的建立臨床上，白色消安（busufan）常用于慢性病的緩解治療，主要用于慢性骨腫瘤的緩解治療。它可以有效地減少所有顆粒的負荷，緩解癥狀，改善患者的狀態(tài)。鼠類具有實驗方便、成本低的優(yōu)勢,大鼠其體內器官較大,與人類臟器解剖結構和生理特征相似,且多次手術不易死亡,成為建立小動物器官疾病模型的首選材料。建立哺乳動物無精子癥模型,可通過注射白消安在大鼠體內創(chuàng)建少精弱精甚至無精子癥狀。本實驗通過腹腔注射不同濃度白消安,觀察大鼠睪丸曲細精管內結構的變化,從而建立更成熟的制備大鼠無精子癥模型的技術,為曲細精管內干細胞移植以及精子重建提供實驗平臺。1材料和方法1.1材料表面1.1.1實驗材料1.1.2藥品、藥品與麻醉劑白消安,2,2,2-三溴乙醇,2-甲基-2-丁醇,二甲基亞砜,甲醇冰醋酸,吉姆薩染液,10%戊二醇溶液,伊紅美藍染液,PI,RH123(以上藥品均由Sigma公司提供)。稱取0.1g白消安粉末溶于10mLDMSO(二甲基亞砜)溶液中,完全溶解后,將濃度為10mg/mL的白消安分裝于1.5mLEppendorf離心管中4℃避光保存?zhèn)溆?注射前將該濃儲液用滅菌生理鹽水稀釋10倍(1mg/mL)用于注射。麻醉劑2,2,2-三溴乙醇2.5g溶于5mL的2-甲基-2-丁醇中,完全溶解后,加100mL雙蒸水將其稀釋到25mg/mL工作液。約200g大鼠注射2mL的麻醉劑。1.2分組及分組將48只40日齡的雄性SD大鼠,體重約為200±5克(g),隨機分為6組:4、4、12、12、6、12。前四組為實驗組,后兩組為空白對照和陰性對照組。1.2.1白消安的單次注射分別將60mg/kg、40mg/kg、30mg/kg、20mg/kg、15mg/kg(mg白消安每公斤大鼠體重)劑量的白消安溶液單次注射于6W左右的SD大鼠腹腔。1.2.2消安累計注射液量10次注射劑量不同濃度的白消安注射于大鼠腹腔,連續(xù)注射10d,白消安累計注射劑量60mg/kg為A組;40mg/kg為B組;30mg/kg為C組;20mg/kg為D組;15mg/kg為E組;對照組分為2組,注射0.5mlDMSO為F組;未注射空白組為G組。1.2.3睪丸的制備以大鼠連續(xù)注射白消安第10d為注射后第0d。分別于注射后第10d、20d、30d、40d、60d采集精液和睪丸標本。大鼠麻醉后,首先將睪丸擠入腹腔,腹部皮膚消毒,用滅菌手術剪于腹中線開口,取出睪丸和附睪,用手術剪剪掉整個附睪,將睪丸浸泡在10%甲醛溶液固定,以備做曲細精管切片。從附睪尾部擠出乳白色精子團,用拉細圓頭玻璃管將精子移入1mL受精液中,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-10min,待精子全部散開用于精子計數(shù)。1.2.4大腿骨細管中的組織結構觀察1.2.5精子畸形率檢測用普通細胞計數(shù)和熒光染色法計數(shù)大鼠附睪精子存活率和濃度。普通計數(shù)一般視動的精子均為有活力精子,包括直線運動、不規(guī)則運動和原地運動;熒光染色使用PI和EH123雙染,通過流式細胞儀精確區(qū)分死精子和活精子。精子畸形率檢測則是將稀釋的精子滴在干凈載玻片上,新蓋玻片推片,干燥后,用固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)固定15min,載玻片背面緩慢流水沖洗,待完全沖洗干凈,晾干。吉姆薩染色1.5h,背面流水沖至正面無藍色,晾干鏡檢。10倍物鏡隨機取5個視野,每次計數(shù)200個精子,計出精子總數(shù)和畸形精子數(shù),取平均值。2結果2.1白消安組大鼠在注射白消安組織單元劑量下注射白消安組單次腹腔注射60mg/kg、40mg/kg、30mg/kg、20mg/kg、15mg/kg劑量白消安溶液的大鼠在注射后第10d全部死亡。2.2連續(xù)10天注射白消安組大鼠2.2.1大鼠睪丸外部形態(tài)變化大鼠連續(xù)注射白消安第10d為注射后第0d算起,A、B、C組大鼠分別在注射后第10d相繼死亡,觀察可見大鼠耳朵蒼白,身體消瘦,成貧血癥狀;睪丸血管破裂,呈紫紅色,如圖1所示。20mg/kg劑量注射組大鼠0d、20d、30d睪丸外部形態(tài)變化比較如圖2所示。隨著注射時間延長,睪丸形態(tài)變小、重量減輕,到30d時,睪丸大約是正常睪丸重量的一半,陰性對照組和空白組睪丸大小沒有明顯變化,如表1所示。2.2.2精子密度和活率檢測圖3所示為大鼠20mg/kg累積劑量(D組)注射后第20d流式細胞儀檢測精子活率結果,其中PI使死精子核染色顯紅色熒光指示死亡精子,RH123用于檢測精子線粒體活性,顯示藍色熒光,可計出精子成活率,圖3右下流式圖紅色熒光峰值較大則說明精子死亡數(shù)達到一半以上。累計20mg/kg劑量(D組)連續(xù)注射后第30d到60d后由于精子密度太低不適合流式細胞儀檢測,故采用普通血細胞計數(shù)器檢測的精子密度和活率。圖2所示注射白消安累積劑量20mg/kg后60d內精子密度分別與空白組(未注射DMSO和白消安)的對比結果。2.2.3精子畸形率檢測畸形精子一般表現(xiàn)為頭部:雙頭、巨大頭、無定形頭;尾部:雙尾、卷尾、缺尾;體部:粗大、折裂、不完整。試驗中通過精子涂片檢測精子畸形率發(fā)現(xiàn)畸形精子大部分為頭部畸形和尾部畸形(圖4),A圖顯示雙尾癥狀、B圖顯示無定形頭、C圖為正常精子。單純注射DMSO組(F組)與空白對照組(G組)數(shù)據(jù)無顯著差異,而實驗組20mg/kg劑量(D組)與空白組(G組)數(shù)據(jù)有顯著差異(圖3)。2.2.4細胞支持細胞睪丸石蠟切片HE染色后顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)20mg/kg劑量組曲細精管內部結構變化最大,注射白消安后20d曲細精管出現(xiàn)空洞,30d時已無精原干細胞,只剩下1、2層支持細胞,而其它組與對照組(圖5)均無顯著性差異。為了進一步說明連續(xù)10d注射白消安累計20mg/kg劑量是最適劑量,本實驗又在另兩組6W左右健康雄性SD大鼠身上注射2d(單次注射1mg/mL白消安2mL)累計20mg/kg的白消安注射劑量和5d(單次注射1mg/mL白消安0.8mL)累計20mg/kg的白消安劑量,發(fā)現(xiàn)注射2d組的大鼠全部死亡,注射5d組的15只中死亡10只,存活的體質明顯變差,耳和四肢發(fā)白,行動遲緩,不利于后續(xù)實驗的進行。3大鼠的實驗研究隨著生活節(jié)奏加快和生活壓力增大,因少精、弱精等因素引起男性不育的比率也在不斷上升。本研究試圖通過對雄性SD大鼠連續(xù)10d腹腔注射一定濃度白消安,建立雄性大鼠無精子癥模型,為同種異體生殖干細胞,成體干細胞移植入睪丸進行體內定向誘導分化提供特定場所,以利于人們更能直接地觀察到外源干細胞在睪丸內的變化,為探究精子發(fā)生過程及睪丸曲細精管內環(huán)境對外源干細胞的接受能力提供實驗依據(jù)和基礎理論。大鼠因其取材方便,易于飼養(yǎng)且功能齊全成為實驗室制備動物模型的最佳材料。有研究表明白消安為西藥成分較單一,易溶于二甲基亞砜(DMSO)等常見藥劑,因DMSO遇水放熱使白消安暫時溶于生理鹽水,所以注射前稀釋濃儲液,并及時腹腔注射,將用藥劑量誤差降到最低。白消安的主要毒性在于抑制骨髓造血干細胞,單次給藥大大增加了大鼠的死亡率本研究通