基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入

基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第1頁目標(biāo)基因克隆三大戰(zhàn)略：1.利用PCR技術(shù)或化學(xué)合成法體外直接合成目標(biāo)基因，然后將之克隆、表示；2.構(gòu)建感興趣生物個體基因組文庫或cDNA文庫；3.利用基因差異表示取得目標(biāo)基因?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第2頁基因分離和取得常見方法一、基因分離物理方法二、鳥槍法(Shotgun)又稱霰彈法三、cDNA文庫建立與基因分離四、基因組文庫法五、基因化學(xué)合成六、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第3頁一、基因分離物理方法

依據(jù)DNA分子兩條鏈存在著G≡C，A=T堿基配對。如DNA分子中某段G≡C堿基對含量高，則其熱穩(wěn)定性就高，其溶解溫度（Tm）就高。這么，大家經(jīng)過控制溶解溫度使富A=T區(qū)解鏈變性，而富G≡C區(qū)仍維持雙鏈。當(dāng)利用單鏈核酸酶S，酶去除解開單鏈個別，得到富G≡C區(qū)DNA片段?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第4頁二、鳥槍法(Shotgun)又稱霰彈法

用限制性內(nèi)切酶將基因組DNA進行切割，得到很多在長度上與普通基因大小相當(dāng)DNA片段（1000bp），然后，將這些片段混合物隨機地重組入適當(dāng)載體，轉(zhuǎn)化后在受體菌（如：E.Coli）中進行擴增，再用適當(dāng)篩選方法篩選出你所要基因。優(yōu)點：操作簡單，命中率較高。缺點：盲目性大，陽性片段不一定恰好是基因，樣本多，可能會漏?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第5頁鳥槍法克隆目標(biāo)基因基礎(chǔ)戰(zhàn)略1、隨機酶切成基因相當(dāng)大小片段（約1000bp)；2、重組入適當(dāng)載體（質(zhì)粒）；3、轉(zhuǎn)化進宿主菌（E.coli)，擴增；4、篩選出含有目標(biāo)基因目標(biāo)重組子，進而取得目標(biāo)基因。鳥槍法適合用于原核細菌目標(biāo)基因克隆分離

+基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第6頁三、基因文庫法cDNA文庫（cDNAlibrary)則是將某生物特定組織器官或發(fā)育時期全部mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并全部克隆成重組子，在該重組子群集中包含了其全部表示基因產(chǎn)物?；蚪M文庫(Genomiclibrary)是將某一生物基因組DNA全部克隆后取得重組子群體總稱?；蛭膸?Genelibrary)是經(jīng)過克隆方法保留在適當(dāng)宿主中某種生物、組織、器官或細胞類型全部DNA片段而組成克隆集合體?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第7頁構(gòu)建基因文庫意義

1.經(jīng)過基因文庫構(gòu)建貯存和擴增特定生物基因組全部或個別片段，保留物種遺傳種質(zhì)。2.從基因文庫中調(diào)出其中任何DNA片段或目標(biāo)基因。3.構(gòu)建基因文庫是研究基因本身需要,如基因結(jié)構(gòu)分析、基因表示和調(diào)控研究等。基因組文庫類型:

質(zhì)粒文庫、噬菌體載體文庫、粘粒文庫、細菌人工染色體文庫和酵母人工染色體文庫。基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第8頁幾個物種基因組大小及基因數(shù)目物種基因組大?。?/p>

106bp）基因數(shù)目衣原體（M.genitalium）0.58470大腸桿菌（E.coli）4.64288酵母（S.cerevisiae）13.56034果蠅（D.melanogaster）16513600線蟲（C.elegans）9719099擬南芥（A.thaliana）13525500人（H.sapines）330035000基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第9頁構(gòu)建基因組文庫應(yīng)滿足條件

基因組文庫完備性：是從基因組文庫中篩選出含有某一目標(biāo)基因重組克隆概率。基因組文庫大小:1）基因組大??；

2）克隆片斷長度；

3）從中分離特定基因置信度。

N=1n(1一P)／ln[1-L/G]

式中P為期望概率，L為單個重組體DNA片段長度，G為基因組DNA總長度。N是所需要重組體數(shù)目

基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第10頁比如，某一哺乳動物基因組G=3x109bp，以17kb隨機片段克隆構(gòu)建文庫中，使任一給定DNA序列達99％概率出現(xiàn)，則：

N＝ln(1-0.99)／ln[1一(17x103／3x109)=8.1x105

假如克隆片斷長為20kb，則N=6.5X105果蠅基因組約1.5X108bp，以20kb克隆時，N=4X105

基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第11頁基因組文庫構(gòu)建

(一）基因組DNA分離制備原核細胞基因組包含其擬核DNA和附加遺傳體系如質(zhì)粒DNA，真核細胞基因組包含其核基因組及細胞器如線粒體和葉綠體DNA。質(zhì)量必須滿足：1.結(jié)構(gòu)含有相對完整性；2.盡可能排除其它大分子成份污染(蛋白質(zhì)、多糖及RNA等)；3.確保提取樣品中不含對酶有抑制作用有機溶劑及離子等。

基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第12頁（二）基因組DNA片段化1.限制性內(nèi)切酶對DNA分子酶解兩種方式：DNA完全酶解和DNA不完全酶解。DNA完全酶解人基因組DNA酶解瓊脂糖凝膠M：DNA分子marker；1：未酶解人基因組DNA；2：RsaI完全酶解后DNAM12基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第13頁DNA不完全酶解人基因組DNA以Sau3A酶進行不完全酶解M：DNA分子marker；1：未酶解基因組DNA；2-10：顯示酶解程度逐步提升M12345678910基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第14頁用DNA隨機片斷克隆法來：機械剪切和個別酶切1)

隨機片斷重合性，能夠沿某一克隆“步查”直至將整個染色體銜接起來（利用片段間重合區(qū)信息，能夠?qū)ⅹ毩⒅亟M子加以銜接，最終整個染色體次序連續(xù)出來：染色體步查）。

2)無須預(yù)知靶序列內(nèi)部及其周圍限制酶切位點而仍能夠分離DNA片段。

3)文庫規(guī)模減小。因為經(jīng)過挑選而用于克隆DNA片段大，形成一個哺乳動物基因組DNA文庫所需重組體數(shù)目顯著降低?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第15頁基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第16頁基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第17頁DNA分子物理剪切

利用識別4對堿基限制性內(nèi)切酶制備隨機性DNA片斷，含有了較高隨機性，但相對隨機性更高方式還是利用不依賴堿基序列物理剪切方法。DNA分子物理剪切能夠采取DNA溶液小孔噴射、超聲波處理和高速攪拌等幾個方式。

基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第18頁選擇適當(dāng)構(gòu)建基因組文庫載體：

1）要求有較大克隆容量；

2）要求在置于宿主中擴增時有較高而均等轉(zhuǎn)化效率；

3）在重組子進行擴增時，擴增機會相近；

4）能夠較方便地進行文庫篩選?；蚪M文庫構(gòu)建常見載體：Lambda噬菌體載體、cosmid、BAC及YAC?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第19頁（三）載體制備

替換型載體進行基因文庫構(gòu)建示意圖基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第20頁基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第21頁（四）重組連接制備出適當(dāng)大小隨機性基因組DNA與載體左臂右臂進行連接，實現(xiàn)左臂—插入分子—右臂分子重組。構(gòu)建文庫時重組連接常采取相同粘性末端連接，以

替換型載體構(gòu)建基因組文庫多采取BamHI酶切末端與插入外源DNASau3AI末端互補連接?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第22頁（五）噬菌體離體包裝：

宿主菌蛋白支架狀前頭部前頭部A蛋白結(jié)合在基因組共聚體cos位點尾部成熟噬菌體頭部功效

噬菌體自組裝及DNA包裝過程基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第23頁（六）重組噬菌體轉(zhuǎn)染大腸桿菌

噬菌體包裝物在宿主大腸桿菌菌苔上檢驗效價及形成噬菌斑基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第24頁其它載體文庫構(gòu)建1.粘粒載體文庫基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第25頁2.酵母人工染色體文庫（yeastartificialchromosome,YAC）:基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第26頁YAC含有酵母染色體自主復(fù)制序列、著絲點(centromere)、四膜蟲端粒（telesome以及酵母選擇標(biāo)識基因組成能自我復(fù)制克隆載體。并帶有大腸桿菌質(zhì)粒載體復(fù)制元件和選擇標(biāo)識。酵母選擇標(biāo)識基因：色氨酸合成酶基因（TRP1），組氨酸合成酶基因（HIS4），尿嘧啶合成酶基因（URA3），赭石突變校正基因（SUP4）。YAC載體以環(huán)狀方式存在，可插入長度達100-kb外源DNA。基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第27頁

與YAC載體配套工作宿主酵母菌帶有一個赭石突變ade2。帶有這個突變酵母菌在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上形成紅色菌落，當(dāng)帶有赭石突變抑制基因sup4載體存在于細胞中時，可抑制ade2-1基因突變效應(yīng)，形成正常白色菌落。無義突變：因為一對或幾對堿基正確改變而使決定某一氨基酸密碼子變成一個終止密碼子基因突變叫無義突變。其中密碼子改變?yōu)閁AG無義突變又叫琥珀突變，密碼子改變成UAA無義突變又叫赭石突變。

基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第28頁細菌人工染色體（BacterialArtificialChromosomesBAC）

細菌人工染色體通常是在大腸桿菌性因子F質(zhì)粒基礎(chǔ)上構(gòu)建，命名為pBACs，其裝載量范圍在50-300kb之間。攜帶一個Cmr，嚴謹型復(fù)制子oriS,解旋酶基因repE,

確保低拷貝質(zhì)粒準(zhǔn)確分配至子代細胞基因座parA,parB,parC及多克隆位點基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第29頁重組分子導(dǎo)入受體細胞

以Lambda噬菌體載體和cosmid載體構(gòu)建重組分子在體外包裝成噬菌體顆粒，經(jīng)過感染細菌方式將重組分子導(dǎo)入受體細胞。以酵母人工染色體和細菌人工染色體載體構(gòu)建重組分子采取電激轉(zhuǎn)化法將重組分子導(dǎo)入受體細胞?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第30頁基因組文庫擴增篩選

1.文庫擴增

lambda載體基因組文庫是以噬菌斑形式取得重組噬菌體集合；

cosmid載體基因文庫是存在于細菌中大分子重組質(zhì)粒，以獨立轉(zhuǎn)化菌落形成集合；BAC文庫也是以細菌菌落形式存在；

YAC文庫則以酵母菌形式出現(xiàn)。噬菌體文庫擴增能夠經(jīng)過感染宿主，每一噬菌斑便是一個重組噬菌體擴增后產(chǎn)物。用緩沖液將這些噬菌斑中病毒洗脫下來，便取得了擴增后文庫。離心除出細菌碎片等雜質(zhì)后，上清液加1-2滴氯仿，置于40C能夠保留數(shù)年。

粘粒載體、BAC和YAC文庫，則對轉(zhuǎn)化菌落單獨編號、擴增和保留。基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第31頁2.文庫篩選硝酸纖維素膜或尼龍膜放射性標(biāo)識探針進行文庫雜交篩選基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第32頁染色體步移(chromosomewalking)

當(dāng)基因位置已知，但沒有可用探針，只知道同一染色體上另外一個已經(jīng)克隆基因，就能夠經(jīng)過染色體步移方法克隆所需基因。

其基礎(chǔ)原理是用探針篩選文庫，得到陽性克隆后，將這個重組載體中插入片段分離出來，然后用這個片段末端個別(注意不能包含重復(fù)序列)作為新一輪篩查文庫探針；得到新重組載體中插入片段，同上一個插入片段末端個別(即探針序列)是重合，共有。也就是這兩個片段是在同一條染色體上相互鄰接。于是，再用新得插入片段末端個別作為探針，再去篩選文庫。經(jīng)過一系列操作，得到插入片段逐步連接延伸，最終能夠步移到待克隆基因?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第33頁

其基礎(chǔ)策略是依據(jù)已知基因片段末端序列合成探針，重復(fù)進行基因文庫篩選，知道滿足需要為止。

染色體步移是一項復(fù)雜、繁瑣技術(shù)，到當(dāng)前為止，步移最大距離時200-250kb。然而成功報道很多，如人類囊腫性纖維化疾病基因?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第34頁cDNA文庫優(yōu)越性：1

cDNA克隆以mRNA為材料，尤其適合用于一些RNA病毒，比如流感病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒和呼腸孤病毒等基因組結(jié)構(gòu)研究及相關(guān)基因克隆分離。2

cDNA基因文庫篩選比較簡單易行。 3．每一個cDNA克隆對應(yīng)于一個mRNA序列，假陽性概率就會比較低，所以陽性雜交信號普通都是有意義，由此選擇出來陽性克隆將會含有目標(biāo)基因序列。4．cDNA克隆可用于在細菌中表示基因產(chǎn)物。

cDNA文庫構(gòu)建與篩選基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第35頁

cDNA文庫大?。篶DNA基因文庫大小估算公式

N=ln(l-P)/ln(l-f)N為cDNA基因文庫必需克隆數(shù)目；P為文庫中含目標(biāo)基因cDNA片段出現(xiàn)概率，普通情況下，期望值為99%；f是某種mRNA豐度?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第36頁

cDNA文庫

用細胞總mRNA制備全套雙鏈cDNA后，建立基因文庫。簡稱c－文庫。基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第37頁

cDNA文庫構(gòu)建：1.cDNA文庫構(gòu)建載體cDNA是由mRNA反轉(zhuǎn)錄取得互補DNA，分子大小通常分布在0.5kb—10kb間。基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第38頁

2.cDNA取得

a.分離mRNA

分離總體RNA：利用guanidinethiocyanate（異硫氰酸胍）?-mercaptoethanol（?-巰基乙醇）使核糖體解體，而染色體不發(fā)生解體，再采取苯酚-氯仿抽提和乙醇沉淀，取得RNA。利用mRNA分子3‘端都含有一段由20-250個多聚腺核苷酸組成poly(A)尾巴將mRNA從細胞總RNA混合物中分離出來?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第39頁GIT與β－巰基乙醇共同作用抑制RNase活性；GIT與十二烷基肌氨酸鈉（Sarcosyl）作用使蛋白質(zhì)變性，從而釋放RNA；酸性條件下DNA極少發(fā)生解離，同蛋白質(zhì)一起變性被離心下來，RNA則溶于上清中。該法所提RNA純度高完整性好較適合純化mRNA，逆轉(zhuǎn)錄及構(gòu)建cDNA文庫，所以為大多數(shù)人采取。與氯化銫方法比較，即使純度稍差一些，小分子RNA，如tRNA、snRNA不易去除，但產(chǎn)量高完整性好，鹽易去除?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第40頁

基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第41頁b.對mRNA進行富集已知要分離目標(biāo)基因mRNA分子大小，經(jīng)過凝膠電泳或蔗糖密度梯度離心，回收與目標(biāo)基因mRNA分子大小相近mRNA。分離未知分子大小目標(biāo)基因cDNA,則可把最初制備總mRNA先經(jīng)過蔗糖密度梯度離心或凝膠電泳，按mRNA分子大小分部回收mRNA。隨即將每個分部回收mRNA進行體外轉(zhuǎn)譯，并結(jié)合使用免疫沉淀和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技木，判定出目標(biāo)基因蛋白質(zhì)產(chǎn)物。再以此分部mRNA構(gòu)建cDNA基因文庫。經(jīng)過離心和電泳分個別離，能夠使低豐度mRNA得以富集。細胞中mRNA依據(jù)其在細胞中拷貝數(shù)，可分為兩大類：一類為高豐度mRNA，通常有100種左右不一樣mRNA，每種mRNA拷貝數(shù)在1,000至10,000間；另一類為低豐度mRNA，包含約10,000種mRNA每種拷貝數(shù)在1至10間?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第42頁c.cDNA合成

cDNA第一鏈合成是以mRNA分子為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，利用適當(dāng)引物引導(dǎo)合成。常見方法有，即oligo-(dT)引導(dǎo)cDNA合成法和隨機引物引導(dǎo)cDNA合成法。oligo-(dT)引導(dǎo)cDNA合成法是利用12-20個脫氧胸腺嘧啶核苷組成oligo-(dT)短片段作為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，以mRNA為模板合成第一鏈cDNA，形成RNA-DNA雜交分子。

基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第43頁cDNA法克隆目標(biāo)基因基礎(chǔ)戰(zhàn)略mDNAcDNA第一鏈合成

5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’cDNA第一鏈引物退火逆轉(zhuǎn)錄酶dNTPs基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第44頁cDNA第二鏈合成

煮沸NaOH本身引導(dǎo)法：取得雙鏈cDNA5’端會有幾對堿基缺失AAAAAAAAAAAAAA5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’TTTTTTTTTTTTTTp

5’TTTTTTTTTTTTTTp

5’AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTOH

3’KlenowdNTPsS1基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第45頁cDNA第二鏈合成

DNApoldNTPsRNaesH置換合成法：取得雙鏈cDNA5’端也會有幾對堿基缺失5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’AAAAAAAAAAAAAAp

5’5’S1

AAAATTTOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’5’TTTTTTTTTTTTTTOH

3’AAAAAAAAAAAAAA5’5’TTTTTTTTTTTTTT3’3’T4-DNAligase基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第46頁cDNA第二鏈合成

dCTP引導(dǎo)合成法：取得雙鏈cDNA能保留完整5’端序列5‘ppp’5G

G

AAAAAOH

3’TTTTTp

5’3‘

HO5‘ppp’5G

G

AAAAACCCCCCCOH

3’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’5‘

pGGGGGGG3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’5‘

pGGGGGGGAAAAAOH

3’NaOH退火KlenowdNTPs基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第47頁雙鏈平頭cDNA通?？寺∪胼d體中三種方法：平頭末端直接與載體連接，但插入片段無法回收平頭兩端分別接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，這么重組分子可經(jīng)過加熱局部變性和S1核酸酶處理回收插入片段加裝人工接頭引入酶切口，方便插入片段回收d.粘性末端片斷與載體連接基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第48頁人工接頭法克隆cDNA入

插入型載體基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第49頁e.離體包裝取得重組噬菌體

基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第50頁文庫篩選：篩選文庫即指從文庫克隆群體中將特定克隆選擇出來過程。分離基因依據(jù)：依據(jù)目標(biāo)基因一些或某個特征來進行克隆篩選及基因分離。對于編碼產(chǎn)物已知目標(biāo)基因：

1.能夠依據(jù)蛋白質(zhì)氨基酸序列推導(dǎo)出核苷酸序列，并以該核苷酸序列作為探針進行直接分離。2.能夠應(yīng)用特定蛋白質(zhì)抗體及蛋白質(zhì)功效測定來篩選對應(yīng)目標(biāo)基因。編碼產(chǎn)物未知目標(biāo)基因：需要用特殊分離伎倆(諸如差異顯示技術(shù)、差異雜交方法等)取得探針，然后再深入從基因文庫中分離得到目標(biāo)基因?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第51頁利用簡并探針篩選cDNA文庫1.利用氨基酸序列信息進行cDNA文庫篩選基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第52頁利用簡并探針篩選cDNA文庫基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第53頁利用標(biāo)識抗體對cDNA文庫進行篩選2.利用標(biāo)識抗體對cDNA文庫進行篩選基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第54頁

3.分子探針雜交方法，經(jīng)過分子雜交后信號，將與探針特異結(jié)合克隆釣取出來。噬菌斑吸印與雜交基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第55頁利用差異雜交方法對文庫進行篩選

基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第56頁4.利用PCR方法進行cDNA文庫篩選基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第57頁基因組文庫與鳥槍法不一樣點1、克隆DNA片段較大（10~30Kb，平均20Kb)，而鳥槍法為1000bp;2、能夠覆蓋宿主DNA全部序列；3、DNA片段要進行分離：分離方法如：蔗糖密度梯度離心凝膠電泳4、載體不一樣?；蚪M文庫法為噬菌體，而鳥槍法為質(zhì)粒。值得注意是，從基因組文庫所分離取得基因序列包含有內(nèi)含子，所以不能直接在原核細胞中表示，但更適合作為如轉(zhuǎn)基因動物等真核表示系統(tǒng)?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第58頁四、基因化學(xué)合成伴隨寡核苷酸化學(xué)合成自動化，基因化學(xué)合成變得更經(jīng)濟、輕易和準(zhǔn)確。前提條件：對基因結(jié)構(gòu)序列清楚。分為：基因片段全化學(xué)合成基因化學(xué)—酶促合成基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第59頁化學(xué)合成單元操作HHDMT：二甲氧基三苯甲基OHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeH激活縮合氧化脫取代基玻璃珠連接臂基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第60頁基因片段全化學(xué)合成混合退火依據(jù)目標(biāo)基因全序列，分別合成正負鏈單鏈DNA片段T4-DNA連接酶連接克隆入適當(dāng)載體

基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第61頁基因化學(xué)——酶促合成混合退火依據(jù)目標(biāo)基因全序列，分別合成單鏈DNA片段T4-DNA連接酶連接克隆入適當(dāng)載體

Klenow酶聚合基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第62頁全長基因合成化學(xué)合成目標(biāo)基因前提條件是基因DNA序列已知，有三種戰(zhàn)略：依據(jù)目標(biāo)基因全序列，分別合成12-15堿基長單鏈DNA小片段。小片段粘接法：

混合退火T4-DNA連接酶連接克隆入適當(dāng)載體

基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第63頁補釘延長法：

混合退火依據(jù)目標(biāo)基因兩條互補鏈全序列，分別合成12-15堿基長單鏈DNA小片段以及20-30堿基長單鏈DNA中片段T4-DNA連接酶連接克隆入適當(dāng)載體

Klenow酶聚合基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第64頁基因化學(xué)合成優(yōu)點1、能夠合成細菌偏愛密碼子2、能夠定向改變個別氨基酸3、能夠在兩端加上需要限制酶切點4、能夠經(jīng)過自動化儀器合成基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第65頁

上述三種方法各有利弊：化學(xué)合成DNA單片段愈短，收率就愈高，但因為化學(xué)合成份額較大，成本較高；在大片段酶促法合成目標(biāo)基因時，即使化學(xué)合成份額相對較小，成本較低，但大片段化學(xué)合成收率極低，比如，每聚合一個單體產(chǎn)物收率為95%則合成50個堿基長DNA單鏈大片段總收率只有7.7%基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第66頁五、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）定義：聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)是指在四種脫氧核苷三磷酸（dNTP）存在下，以寡聚核苷酸為引物，以單鏈DNA為模板，經(jīng)DNA聚合酶催化，合成DNA互補鏈到達基因擴增目標(biāo)過程?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第67頁PCR技術(shù)反應(yīng)周期包含三個步驟：1、高溫變性：經(jīng)過加熱使得復(fù)制雙螺旋DNA變性分離為單鏈，作為模板。（>91℃，1分鐘）。2、低溫退火：（約50℃，1分鐘）使專門設(shè)計一對寡核苷酸引物在此低溫條件下分別與單鏈模板DNA兩端互補區(qū)段互補結(jié)合。3、適溫延伸：將反應(yīng)混合物溫度上升到72℃，保溫1分鐘?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第68頁基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第69頁PCR原理圖

基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第70頁PCR反應(yīng)必要條件：須知基因兩端個別序列PCR反應(yīng)中幾個關(guān)鍵原因1、TaqDNA聚合酶2、引物長度3、模板4、Mg濃度5、溫度循環(huán)參數(shù)PCR反應(yīng)優(yōu)點：1、操作簡單2、通用性好3、成功率高PCR主要參數(shù)確定：退火溫度Mg2+

反應(yīng)時間循環(huán)次數(shù)基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第71頁RE1RE2Sequencing已知靶序列擴增側(cè)翼序列PCR常規(guī)PCR衍生幾個基因克隆技術(shù)（一）反向PCR(inversePCR)基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第72頁（二）熱不對稱交織PCR(thermalasymmetricinterlacedPCR,TAIL-PCR)簡并引物是指用來編碼一段短肽序列不一樣堿基序列混合物。

原理：依據(jù)目標(biāo)序列側(cè)翼已知序列設(shè)計３個嵌套特異引物（sp1,sp2,sp3,約20bp），用它們分別和一個含有低Tm值短隨機簡并引物（arbitrarydegenerateprimer,AD,約14bp)相結(jié)合，以基因組為模板，依據(jù)引物長度及特異性差異設(shè)計不對稱溫度循環(huán)，經(jīng)過分級反應(yīng)來擴增特異引物。TAIL-PCR分三輪反應(yīng)基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第73頁基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第74頁（1）提取基因組totalRNA（2）反轉(zhuǎn)錄合成總cDNA作模板（4）PCR擴增（3）依據(jù)目標(biāo)基因序列設(shè)計引物(三）從mRNA中擴增:RT-PCR原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。適合擴增真核生物基因?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第75頁目標(biāo)基因引物1反轉(zhuǎn)錄成目標(biāo)基因cDNA第一鏈目標(biāo)基因引物2目標(biāo)基因cDNA第二鏈PCRmRNA基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第76頁（四）錨定PCR（五）cDNA末端快速擴增cDNA末端快速擴增（rapidamplificationofcDNAends,RACE）是克隆目標(biāo)基因cDNA一個常見方法。這種方法依據(jù)基因編碼蛋白同源性或者多個同源基因cDNA比較變異情況，將同源性基因cDNA關(guān)鍵區(qū)段分析出來，針對關(guān)鍵區(qū)段保守性高位點設(shè)計引物，然后利用RT-PCR先擴增和克隆關(guān)鍵序列區(qū)。在測定關(guān)鍵序列后，依據(jù)關(guān)鍵序列設(shè)計新引物并分別進行cDNA3

端和5

端擴增。最終拼湊成cDNA全序列信息并設(shè)計新一對引物將其RT-PCR擴增并克隆?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第77頁RACE示意圖

基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第78頁利用oligo(dT)引物反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈后，以關(guān)鍵區(qū)段引物擴增出中間關(guān)鍵片段，測序后能夠設(shè)計出3

RACE上游引物和5

下游引物，3

端上游引物結(jié)合oligo(dT)下游引物將cDNA3

端克隆出來?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第79頁1.分析關(guān)鍵區(qū)段利用已克隆人和果蠅基因資料，克隆蚊子胰蛋白酶基因cDNA。先比較人和果蠅胰蛋白酶氨基酸序列同源性.2.設(shè)計簡并引物和擴增關(guān)鍵區(qū)段

氨基酸序列

W(Trp)V(Val)L(Leu)T(Thr)A(Ala)

密碼子

UGGGTTTTAACTGCT

CGCCACTTAAGCGGGA基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第80頁3.設(shè)計RACE引物擴增關(guān)鍵區(qū)段克隆和測序后，即取得了目標(biāo)基因中間個別序列，依據(jù)這一序列分別設(shè)計3

RACE上游引物和5

RACE下游引物。4.3

端RACEcDNA3

快速克隆比較簡單，依據(jù)中間關(guān)鍵序列設(shè)計出3

端RACE上游引物后，利用oligo(dT)作為下游引物，利用mRNA反轉(zhuǎn)錄體系作為模板，PCR在兩引物間將cDNA3

端擴增出來?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第81頁5.5

端RACE5

端RACE時，盡管其下游引物依據(jù)克隆關(guān)鍵序列能夠確定下來，但因為5

端上游序列還未知，上游引物難以確定，因而5

RACE要采取一些特殊方法確定其上游引物位點?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第82頁BD企業(yè)SMARTcDNA5

端RACE試劑盒原理圖基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第83頁在反轉(zhuǎn)錄酶（RT）作用下，利用Oligo(dT)作引物合成cDNA第一鏈，RT在cDNA第一鏈末端延伸合成了幾個C堿基，體系中加入3

端為G堿基寡聚序列與cDNA末端互補，作為cDNA繼續(xù)延伸合成模板，在cDNA末端合成出一段已知序列，形成5

RACE引物位點。基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第84頁五、依據(jù)基因差異表示取得目標(biāo)基因1.差異顯示PCR（DD-PCR）差異顯示技術(shù)原理和試驗程序:

1992年，Liang和Pardee首次提出差異顯示技術(shù)(DD-PCR)，其基礎(chǔ)原理是，利用一系列oligo(dT)引物，逆轉(zhuǎn)錄真核生物細胞中全部表示mRNA，經(jīng)過PCR擴增方法，轉(zhuǎn)換成cDNA雙鏈，再利用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，將有差異片段分開，篩選出目標(biāo)基因。其技術(shù)普通包含以下步驟：(1)從植物組織中提取總RNA，在這個步驟中注意不能有DNA污染，普通用無RNA酶DNA酶在37℃下處理30min；基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第85頁(2)在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，以O(shè)ligo(dTMN)為引物(M為G、A、C中任一個，N為A、C、G、T任一個)，進行逆轉(zhuǎn)錄；(3)PCR反應(yīng)，擴增cDNA第一條鏈；(4)擴增后cDNA進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，使差異表示cDNA片段在6%測序膠上分開；(5)找出不一樣處理間差異顯示條帶，從膠上切割下來，并回收，再進行第二次擴增；(6)克隆差異片段，差異片段可作為探針；(7)Northern雜交，驗證目標(biāo)片段，去掉假陽性片段；(8)對目標(biāo)片段進行測序；(9)以克隆目標(biāo)片段為探針，從基因組文庫中篩選出對應(yīng)全長基因?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第86頁DD-PCR法含有快速、靈敏、簡單和可分析低豐度mRMA優(yōu)點已為植物基因表示研究和基因克隆所證實。但也有一些缺點，如擴增片段短、假陽性高、檢測全部mRMA工作量大、基因克隆受mRMA表示時效性影響等。基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第87頁DD-PCR技術(shù)流程基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第88頁2.mRNA差異顯示PCR（DDRT-PCR）mRNAdifferentialdisplayRT-PCR（1）3’端錨定引物Oligo(dT)引物3’端加兩個核苷酸（倒數(shù)第二個不再是T）。

AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3’

5’

NMTTTTTTTTM：A、GorCN:A、G、TorC5’

3’

基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第89頁（2）12種錨定引物AGTTTTTTTT5’

3’

CGTTTTTTTT5’

3’

GGTTTTTTTT5’

3’

TGTTTTTTTT5’

3’

AATTTTTTTT5’

3’

CATTTTTTTT5’

3’

GATTTTTTTT5’

3’

TATTTTTTTT5’

3’

ACTTTTTTTT5’

3’

CCTTTTTTTT5’

3’

GCTTTTTTTT5’

3’

TCTTTTTTTT5’

3’

基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第90頁（3）5’端隨機引物10mer

AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3’

5’

NMTTTTTTTT5’

3’

擴增cDNA第一鏈。RTNMTTTTTTTT5’

cDNA3’

NNNNNNNNNN5’

3’

NNNNNNNNNN5’

3’

cDNA第二鏈，并PCR基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第91頁（4）隨機引物與錨定引物成對擴增12種錨定引物，若與20種隨機引物，可組成240組引物。引物組合：240組在能分出0多條帶！試驗結(jié)果：假如每條帶相當(dāng)于一個mRNA，0mRNA基礎(chǔ)上反應(yīng)了一個特定細胞中全部mRNA。在測序膠上，每組擴出50-100條長度為100-500bp帶?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第92頁（5）隨機-錨定引物PCR產(chǎn)物電泳比較不一樣組織240組引物組合PCR產(chǎn)物在測序膠中電泳。選擇有差異帶，深入PCR作探針。篩選文庫，找到差異基因全長序列。基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第93頁3.代表性差異分析此法是由Hubank和Schatz1994年提出。將合成cDNA酶切，經(jīng)過降低cDNA群體復(fù)雜度和屢次更換cDNA兩端接頭等方法，特異擴增目標(biāo)基因片段，重復(fù)性好，假陽性低。其主要步驟是，提取總RMA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用識別4個堿基限制性內(nèi)切酶消化，連接接頭，擴增出不一樣代表子，進行Tester與Driver雜交，消減雜交富集，從而找出差異cDNA片段。

基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第94頁SchematicdiagramofimprovedcDNArepresentationaldifferenceanalysis(RDA)procedure基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第95頁BasicstrategyforcDNA-basedrepresentationaldifferenceanalysis.基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第96頁第五節(jié)重組DNA向宿主細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移技術(shù)因為外源基因與載體組成重組DNA分子性質(zhì)不一樣、宿主細胞不一樣，將重組DNA導(dǎo)入宿主細胞詳細方法也不相同。轉(zhuǎn)化：是指微生物細胞直接吸收外源DNA過程。是使重組體DNA分子在熱休克短暫時間內(nèi)被導(dǎo)入受體。熱休克后將受體菌在不含抗生素培養(yǎng)液中生長最少30分鐘以上，使其蛋白得到足夠表示，方便能在含抗生素瓊脂培養(yǎng)平板上生長。因為E.coliX1776菌株用CaCl2處理后制備感受態(tài)細胞長久冷藏仍能保持其攝取外源DNA能力，故常見作受體菌。轉(zhuǎn)染：是指噬菌體、病毒、或以其為載體構(gòu)建重組DNA導(dǎo)入細胞過程。(其中又分磷酸鈣沉淀法與體外包裝法)轉(zhuǎn)導(dǎo)：重組噬菌體DNA或重組粘粒DNA必須包裝成完整噬菌體顆粒，經(jīng)過溫和噬菌體顆粒釋放和感染將重組DNA轉(zhuǎn)移至宿主內(nèi)過程。基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第97頁重組DNA導(dǎo)入受體細胞路徑轉(zhuǎn)化：transfermation，經(jīng)過生物學(xué)或理化方法使質(zhì)粒DNA或以質(zhì)粒DNA為載體構(gòu)建重組DNA導(dǎo)入受體細胞內(nèi)，并在受體內(nèi)穩(wěn)定維持和表示過程，主要用于原核生物。轉(zhuǎn)染：transfection，是轉(zhuǎn)化一個特殊形式，指病毒或以病毒為載體構(gòu)建重組DNA導(dǎo)入受體細胞，并使宿主遺傳性狀發(fā)生改變過程，其中包含DNA、RT-DNA及RNAi，主要用于原核生物。轉(zhuǎn)導(dǎo):(transduction)以噬菌體作載體構(gòu)建重組體導(dǎo)入受體細胞過程。基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第98頁1.直接轉(zhuǎn)化法有微生物細胞在不加任何處理情況下就能直接攝取外源DNA，只要外源DNA與這么細胞混合，在適宜條件下懸浮培養(yǎng)，就能完成外源DNA轉(zhuǎn)化。細菌轉(zhuǎn)化：指一個細菌菌株因為捕捉了來自另一細菌菌株DNA，而造成性狀特征發(fā)生遺傳性改變生命過程。這種提供轉(zhuǎn)化DNA菌株叫給體菌株，而接收轉(zhuǎn)化DNA寄主菌株叫受體菌株?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第99頁大腸桿菌是當(dāng)前基因工程中最常見受體細胞。通常采取是大腸桿菌感受態(tài)細胞，即在冰浴中用一定濃度CaCl2處理對數(shù)生長久大腸桿菌，以取得高效轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞。也有采取Rb+、Mn2+、K+、二甲亞礬、二硫蘇糖醇(DTT)或用氯化己胺鈷處理制備感受態(tài)細胞。感受態(tài)：是指受體細胞能吸收外源DNA分子而有效地作為轉(zhuǎn)化受體一些生理狀態(tài)。普通受體細胞在對數(shù)生長久轉(zhuǎn)化能力最強。感受態(tài)細胞(competentcell):含有易于接收外源DNA能力細胞。基因工程中，宿主細胞需經(jīng)人工處理成能吸收重組DNA分子敏感狀態(tài)，才能用于轉(zhuǎn)化，這種敏感細胞稱為人工感受態(tài)細胞?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第100頁感受態(tài)細胞制取普通是將細菌（如大腸桿菌等）用一定濃度冰涼CaCl2處理而得。1970年建立此技術(shù)，其原理是Ca2+與細菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細胞膜出現(xiàn)空隙，細菌細胞變?yōu)楦惺軕B(tài)細胞。

為了得到很好感受態(tài)細胞，需注意以下幾點：1、細胞要處于對數(shù)生長久2、整個制備過程要在低溫（0~4℃）進行3、為了提升轉(zhuǎn)化率，可選取復(fù)合氯化鈣溶液基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第101頁操作程序：1處于對數(shù)生長久細菌置于0℃CaCl2低滲溶液中，使細胞膨脹，同時Ca2+使細胞磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，使得外膜與內(nèi)膜間隙個別核酸酶離開所在區(qū)域，組成大腸桿菌人工誘導(dǎo)感受態(tài)；2加入DNA，Ca2+與DNA形成抗脫氧核糖核酸酶羥基-磷酸鈣復(fù)合物，并粘附在細菌細胞膜外表面；3經(jīng)短暫42℃熱激處理后，細菌細胞膜液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生猛烈擾動，出現(xiàn)許多間隙，造成通透性增加，DNA分子進入細胞中?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第102頁基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第103頁2.化合物誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化法原理：外源DNA與多聚物（聚乙二醇(PEG)、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等）、二價陽離子（Mg、Ca、Mn等）混合，再與受體細胞或原生質(zhì)體混合，可使外源DNA進入細胞。尤以PEG應(yīng)用最廣，可用于原核生物細胞、動物細胞和植物原生質(zhì)體基因轉(zhuǎn)化?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第104頁PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化Davey1980年和Krens1985年首先建立。步驟轉(zhuǎn)化培養(yǎng)：將制備原生質(zhì)體懸浮液與重組DNA一起保溫培養(yǎng)，同時加入PEG在pH8-9下促進原生質(zhì)體攝取DNA，從而使細胞轉(zhuǎn)化。通常使用PEG分子量3000左右。轉(zhuǎn)化效率很低10-5—10-6基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第105頁3.高壓電穿孔轉(zhuǎn)化法（1）Electroproration原理：利用高壓電脈沖作用，使細胞膜上產(chǎn)生可逆瞬間通道，從而促進外源DNA和高分子物質(zhì)進入細胞質(zhì)內(nèi)而實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化，但不傷及細胞，切斷電場后，被擊穿膜孔能夠自行恢復(fù)。當(dāng)電場強度和脈沖時間結(jié)合造成50-70%細菌死亡時，轉(zhuǎn)化水平最高?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第106頁（2）過程：把宿主細胞置于外加電場中，經(jīng)過電脈沖作用在細胞膜上打孔，DNA分子進入細胞。（3）條件：電壓300~600V、時間20~100ms、溫度0℃。（4）適用范圍：酵母菌、霉菌等真核生物，適合用于農(nóng)桿菌感染不敏感植物。（5）形式：電穿孔電穿孔+PEG。轉(zhuǎn)化效率10-5—10-6，1.2%基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第107頁比如：高壓電穿孔法轉(zhuǎn)化細菌對數(shù)生長久細菌冷卻離心低鹽緩沖液清洗用10%甘油懸浮細胞干冰速凍-70℃貯存使用期6W外加電場（300-600V維持20—100ms）電脈沖轉(zhuǎn)化細胞0-4℃基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第108頁4.微彈轟擊轉(zhuǎn)化法（microprojectilebombardment,particlebombardment）該法亦稱基因槍法(particlegun)，粒子轟擊法，生物彈法（Biolistics）。（1）原理：金屬微粒在外力作用下，到達一定速度后，將包裹在金屬顆粒表面外源DNA分子隨金屬顆粒一起進入植物細胞，但又不引發(fā)細胞致命傷害而維持正常生命活動。（2）過程：外源DNA與鎢、金等金屬微粒混合，使DNA吸附在微粒表面；用基因槍轟擊，經(jīng)過氦氣沖擊波使DNA隨金屬微粒進入植物細胞?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第109頁（3）適用范圍：植物細胞。（4）特點：操作簡單，轉(zhuǎn)化率高，省去了分離原生質(zhì)體麻煩，耗資較大。基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第110頁DNA微粒載體制備原理是CaCl2對DNA沉淀作用，亞精胺、聚乙二醇含有粘附作用、將這些化合物與DNA混合后與鎢粉或金粉混合，吹干后，則DNA沉淀在載體顆粒上基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第111頁基因槍介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)移基因槍法最早是由美國康奈爾大學(xué)Sanford(1987)最先提出。它經(jīng)過高速飛行金屬顆粒將包被其外目標(biāo)基因直接導(dǎo)入到受體細胞內(nèi)，從而實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化方法。1992年，世界首例轉(zhuǎn)基因小鼠就是經(jīng)過該法取得?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第112頁一類是以火藥爆炸力作為動力加速微彈；第二類是以高壓氣體(highpressuregas)作為動力，如以氦氣、氫氣、氮氣等。其工作原理是把載有DNA鎢(金)粉噴灑在一張微粒載片上，電極間懸滴著微水滴。在壓縮空氣沖擊下，微水滴霧狀噴射，驅(qū)動載片。當(dāng)載片受阻于金屬篩網(wǎng)時,載有DNA鎢(金)粒繼續(xù)向下沖擊射入細胞。第三類是以高壓放電為驅(qū)動力。其最大優(yōu)點是能夠無級調(diào)速，經(jīng)過改變工作電壓，粒子速度及射入濃度可準(zhǔn)確控制，使載有DNA鎢(金)粉粒子能抵達含有再生能力細胞層。這一點非常主要，因為不一樣外植體需要不一樣參數(shù)。采取該放電轟擊、已在大豆和水稻上成功地取得了轉(zhuǎn)基因植株(Christou等，1992)

基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第113頁基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第114頁基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第115頁5.顯微注射法（microinjection）（1）原理：利用顯微注射儀，經(jīng)過機械方法把外源DNA直接注入細胞質(zhì)或細胞核（需用特制玻璃微管）。倒置顯微注射儀基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第116頁基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第117頁（2）過程：將外源基因直接注入試驗動物受精卵原核，外源基因整合到動物基因組，經(jīng)過胚胎移植把含有外源基因受精卵移植到受體子宮并發(fā)育。（3）適用范圍：真核生物，早期用于動物，現(xiàn)已應(yīng)用于植物。（4）特點：繁瑣耗時、轉(zhuǎn)化率高，但需專門顯微注射儀，且要求操作者有精細操作技術(shù)和低密度細胞培養(yǎng)技術(shù)?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第118頁受體細胞固定動物細胞含有獨特貼壁生長待性，不存在固定細胞問題植物細胞必須先建立細胞固定技術(shù)當(dāng)前有三種方法：①瓊脂糖包埋法：把低熔點瓊脂糖熔化，冷卻到一定溫度后將制備細胞懸浮液混合于瓊脂糖中。需要注意問題是，在包埋時細胞約1/3-1/2暴露在瓊脂糖表面，即細胞體二分之一埋在瓊脂糖中，起固定作用，暴露二分之一細胞可一進行微針注射、不然瓊脂固化后極難進行。②多聚-L-賴氨酸粘連法：先用多聚-L-賴氨酸處理玻片表面，因為聚賴氨酸對細胞有粘連作用，所以當(dāng)分離細胞或原生質(zhì)體與玻片接觸時被固定在玻片上。而且一個破片上可固定較多數(shù)量細胞或原生質(zhì)體。③吸管支持法：用一固定毛細管將原生質(zhì)體或細胞吸著在管口起到固定作用，然后再用微針進行DNA注射。這種方法優(yōu)點是吸管能夠旋轉(zhuǎn)或移動位置．使操作者能選擇最正確位置進行注射。顯微注射用微針通常見拉針機制備，尖針直徑以0.5μm左右為宜。一次注入細胞質(zhì)中DNA量約為10-9／ml?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第119頁轉(zhuǎn)化率及影響原因

顯微注射即使操作繁瑣耗時，但其轉(zhuǎn)化效率很高已發(fā)展出一套完善技術(shù)，在煙草、油菜、苜蓿等植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化率高達60％以上。影響轉(zhuǎn)化率原因。(1)原生質(zhì)體成活率是轉(zhuǎn)化率主要原因，只有注射那些能夠分裂、成活原生質(zhì)體才能得到轉(zhuǎn)化。所以，注射時要選擇開啟分裂、細胞壁開始形成原生質(zhì)體進行注射。

(2)線性DNA比環(huán)形DNA含有更高轉(zhuǎn)化率。

(3)操作要快速靈敏，選擇最正確注射強力和濃度，使細胞損傷降低到最小程度。

(4)固定技術(shù)要可靠，不能損傷細胞?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第120頁顯微注射特點①方法簡單、轉(zhuǎn)化率高；6-8%②它是一個純粹物理方法，適合用于各種植物和各種材料，無不足；③整個操作過程對受體細胞無藥品等毒害，有利于轉(zhuǎn)化細胞生長發(fā)育；④轉(zhuǎn)化細胞培養(yǎng)過程無需特殊選擇系統(tǒng)。缺點是需要有精細操作技術(shù)及低密度培養(yǎng)基礎(chǔ)，注射速度慢、效率低，要求研究者有耐心。基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第121頁6.脂質(zhì)體（liposome）介導(dǎo)法（1）原理：受體細胞細胞膜表面帶負電荷，脂質(zhì)體顆粒帶正電荷，利用引力作用把遺傳物質(zhì)導(dǎo)入細胞內(nèi)。即用脂類化學(xué)物質(zhì)包裹DNA成球體，經(jīng)過植物原生質(zhì)體吞噬或融合作用把內(nèi)含物轉(zhuǎn)入受體細胞。脂質(zhì)體是依據(jù)生物膜結(jié)構(gòu)功效特征合成生物膜，然后把DNA包裹在人工膜內(nèi)。基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第122頁基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第123頁（2）過程：在形成脂質(zhì)體時，把用來轉(zhuǎn)染目標(biāo)DNA分子包裹在其中；脂質(zhì)體與細胞接觸；外源DNA分子導(dǎo)入受體細胞。（3）適用范圍：真核細胞。（4）特點：包在脂質(zhì)體內(nèi)DNA可免受細胞內(nèi)核酸酶降解，所以可直接轉(zhuǎn)化外源DNA；對植物病毒RNA轉(zhuǎn)化率高；如用PEG誘導(dǎo)脂質(zhì)體與原生質(zhì)體融合可取得高轉(zhuǎn)化率。4ⅹ10-5(5)影響脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化率原因很多：①脂質(zhì)體制備類型、方法都有顯著差異；②PEG濃度、加入時間、PH值及ca”濃度均起到主要作用；③保溫培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化時條件一樣十分主要。基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第124頁7.花粉管通道法（1）原理：在花粉管通道形成之后封閉之前一段時間，使外源DNA能沿著花粉管通道進入胚囊，轉(zhuǎn)化尚不具正常細胞壁卵細胞、合子或早期胚胎細胞，從而實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移。（2）適用范圍：植物基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第125頁（3）特點：直接得到轉(zhuǎn)化種子，不經(jīng)過組培，降低了基因型影響；操作簡單經(jīng)濟，無需昂貴儀器和化學(xué)藥品，可直接在大田操作；大量快捷，性狀穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化率高；可取得1×10-2~1×10-1高遺傳轉(zhuǎn)化率。

不但能夠?qū)牍w總DNA，而且可導(dǎo)入含目標(biāo)基因質(zhì)粒，甚至可將化學(xué)誘變劑導(dǎo)入胚囊。缺點：工作時間受自然花期限制，田間操作受環(huán)境影響大，基因組以隨機方式結(jié)合，要求工作人員經(jīng)濟性要強，工作效率較低?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第126頁我國科學(xué)家周光宇在1983年首次在“MethodsinEn-zymology”報道研究結(jié)果。現(xiàn)該技術(shù)主要在蔬菜育種上應(yīng)用。（白菜、茄子、黃瓜、番茄、辣椒等操作步驟:1.外源DNA制備2.分析受體植物受精過程及時間，確定導(dǎo)入外源DNA時間方法（3種）柱頭涂抹法柱頭切除法花粉粒吸入法3.后代材料處理基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第127頁8.超聲波介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法（1）原理：利用低音強脈沖超聲波物理作用，可逆性擊穿細胞膜并形成過膜通道，使外源DNA進入受體細胞。（2）特點：防止脈沖變電壓對細胞損傷，有利于細胞存活整個操作轉(zhuǎn)化率較高，如在轉(zhuǎn)化反應(yīng)中加入DMSO或攜帶DNA則轉(zhuǎn)化率更高。60-70%（3）適用范圍：微生物、植物基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第128頁過程:無菌材料制備質(zhì)粒DNA提取超聲波緩沖液配置超聲波處理（去無菌材料切成小塊，放入無菌超聲波小室，同時加入5%DMSO緩沖液，質(zhì)粒DNA20ug/ml及鮭魚精DNA40ug/ml，室溫下超聲波處理30min）處理后用緩沖液洗3次接種在MS或其它培養(yǎng)基上培養(yǎng)基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第129頁9.激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法早在1984年Tao等首先利用激光微束對動物細胞進行DNA轉(zhuǎn)化試驗、此庸Web等利用激光微束技術(shù)對原生質(zhì)體、花粉以及活細胞內(nèi)葉綠體進行外源DNA導(dǎo)入取得成功，并用熒光標(biāo)識大腸桿菌pBR322質(zhì)粒DNA在轉(zhuǎn)化細胞中得到檢測。（1）原理：利用直徑很小、能量很高激光微束能引發(fā)細胞膜可逆性穿孔原理。在熒光顯微鏡下找適合細胞，然后用激光代替熒光光源，聚焦后發(fā)出激光微束脈沖，造成膜穿孔外于細胞周圍外源DNA分子隨之進入受體細胞。（2）特點：操作簡便快捷，轉(zhuǎn)化效率高10-3-10-4，無宿主限制，但需要珍貴儀器，技術(shù)條件要求高，穩(wěn)定性和安全性不如電穿孔法和基因槍法。（3）適用范圍：動植物細胞、組織、器官及線粒體、葉綠體。基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第130頁過程1）DNA提取2)受體植物樣品制備：將欲照射植物細胞或組織用高滲緩沖液浸泡數(shù)分鐘，不一樣作物不一樣外植體所用高滲液不一樣，浸泡時間也不一樣。

3)轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞懸浮液準(zhǔn)備：激光照射前洗去高滲液，加新鮮培養(yǎng)液。吸收0.5mI細胞懸浮液，加50ul質(zhì)粒DNA或植物外源DNA(濃度5ug／ml)．一起注入激光微束系統(tǒng)Rose小室。4)激光微束照射：激光微束顯微照射裝置如為Nd—YAG四集倍頻脈沖激光冠微照射系統(tǒng)、即輸出波長技需要選擇，脈寬10-15ns。激光束引入一臺相差顯微鏡，用40ⅹ物鏡聚焦Y于欲照射細胞。光斑直徑為1.3nm。照射時移動載物臺，使激光脈沖在植物細胞團上進行掃描照射，照射時間每個佯品60分鐘，約打7000個脈沖。

5)培養(yǎng)：激光照射后，將樣品用新鮮培養(yǎng)液沖洗1-2次，然后接種在裝有液體培養(yǎng)基小培養(yǎng)皿中，25度條件下懸浮培養(yǎng)2-3天或固體培養(yǎng)?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第131頁基因工程目的基因的分離和獲得和重組基因的導(dǎo)入第132頁10.病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)法（1）原理：用病毒(噬菌體)DNA(或RT-DNA)構(gòu)建克隆載體或攜帶目標(biāo)基因克隆體，在體外包裝成病毒(噬菌體)顆粒后，感染受體細胞，使其攜帶重組DNA進入受體細胞，將此過程稱為病毒(噬菌體)顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)法。（2）適用范圍：主要用于構(gòu)建基因文庫和目標(biāo)轉(zhuǎn)基因，早期也用于植物轉(zhuǎn)基因。（3）類型：帶有目標(biāo)基因病毒顆粒直接感染受體細胞，目標(biāo)基因打隨同病毒DNA分子整合到受體細胞染色體DNA上，這么以后不需要再包裝成病毒顆粒。帶有目標(biāo)基因病毒是缺點型，需同另一輔助病毒一起感染受體細胞，在受體細胞內(nèi)包裝成新病毒顆粒。即使帶有目標(biāo)基因SV40早期轉(zhuǎn)錄是缺點型，但被感染cos細胞系基因組中整合SV40早期轉(zhuǎn)錄區(qū)段DNA，所以無需輔助病毒做混合感染?；蚬こ棠康幕虻姆蛛x和獲得和重組基因的導(dǎo)入第133頁11.磷酸鈣轉(zhuǎn)染法（1）原理：哺乳動物細胞能捕捉黏附在細胞表面DNA-磷酸鈣沉淀物，使DNA轉(zhuǎn)入細胞。（2）基礎(chǔ)操作過程：將待轉(zhuǎn)染外源DNA同CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液，逐滴加入到不停攪拌Hepers-磷酸鈣溶液中，形成DNA-磷酸鈣共沉淀復(fù)合物；用吸管將沉淀復(fù)合物黏附在哺乳動物單層培養(yǎng)細胞表面；保溫幾小時后，用新鮮培養(yǎng)液洗凈細胞，再用新鮮培養(yǎng)茹繼續(xù)培養(yǎng)，直至外源基因表示。（3）特點：多使用高濃度DNA，10~50μg/ml；保溫時間隨受體細胞而異；Hepers-磷酸鈣溶液應(yīng)不停攪拌，DNA溶液則應(yīng)遲緩加入，不然形成大塊狀顆粒，不利于受體