茶樹蛋白質(zhì)提取純化及雙向電泳的研究

茶樹蛋白質(zhì)提取純化及雙向電泳的研究

功能誘導(dǎo)組研究的繁榮促進(jìn)了蛋白質(zhì)組學(xué)作為后基因組時(shí)代的研究?jī)?nèi)容之一。雙向凝膠電泳技術(shù)是蛋白質(zhì)組研究的三大關(guān)鍵核心技術(shù)之首1材料和方法1.1材料表面取自福建農(nóng)林大學(xué)教學(xué)試驗(yàn)茶場(chǎng)的毛蟹品種,一芽二葉,液氮固樣,貯存于-80℃冰箱備用。1.2蛋白質(zhì)提取與生化方法1:樣品用液氮研磨,過濾后,按文獻(xiàn)[14],即人體細(xì)胞蛋白質(zhì)雙向電泳方法進(jìn)行。方法2:按文獻(xiàn)[12],即水稻蛋白質(zhì)雙向電泳分析新方法進(jìn)行。方法3:按文獻(xiàn)[11],即荔枝蛋白質(zhì)雙向電泳的改良方法進(jìn)行。方法4(改良方法):蛋白質(zhì)丙酮干粉制備:研缽用適量的液氮預(yù)冷后,加入0.4g的水不溶性PVP(Waterinsolublepolyvinylpyrrolidone),0.1gDTT(dithiothreitol)和茶葉樣品2.0~2.5g,在液氮中研磨成粉末,轉(zhuǎn)入10ml離心管,懸浮于8倍體積的-20℃預(yù)冷丙酮[含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%TCA(trichloroaceticacid)和體積分?jǐn)?shù)為0.07%β-Me(β-Mercaptoethanol)]。渦旋振蕩后于-20℃靜置1h,4℃,15000g離心15min。棄上清液,取沉淀,加入6倍體積的-20℃預(yù)冷丙酮(含0.07%β-Me),渦旋后于-20℃靜置2~3h。同上離心,棄上清,取沉淀,重復(fù)兩次。最后取沉淀,用封口膜封住管口,于-20℃放置3h,揮發(fā)去丙酮,真空干燥,在未充分干燥前,不斷攪拌蛋白沉淀,以免結(jié)快,使之成粉末狀,即成蛋白質(zhì)丙酮干粉,置于-20℃保存?zhèn)溆谩５鞍踪|(zhì)提取:稱取蛋白質(zhì)丙酮干粉40mg,以1:20(mg/ìl)加入樣品裂解液[9.5mol/Lurea,2.0%(V/V)NP-40(NonidetP-40),0.5%(V/V)兩性電解質(zhì)載體(AmpholinepH4-7,pH6-9,pH3.5-10比例為2:1:1),5mmol/Lβ-Me(β-Mercaptoethanol)]。渦旋振蕩后于37℃水浴2h。4℃,15000g,離心15min,取上清,按1:4(v/v)加入-20℃預(yù)冷丙酮(含5mmol/Lβ-Me)于室溫下沉淀蛋白2h,同上離心,棄上清,加入適量的上述樣品裂解液復(fù)溶,37℃水浴2h,取少量上清用BCA法測(cè)定總蛋白的濃度固相pH梯度雙向電泳:第一向固相pH梯度等點(diǎn)聚焦(IEF電泳):總蛋白質(zhì)提取物(1000μg)與水化液[8mol/Lurea,0.5%TritonX-100,4.0%CHAPS(3-[(3-cholamidopeopyl)dimethylammonio]-1-tropanesulfonicacid),18mmol/LDTT,0.5%IPG(ImmobilizedpHgradients)緩沖液pH3-10L,痕量溴酚藍(lán)]充分混合,總體積350ìl,15000g離心30s,取上清,加入IPGstrip持膠槽,將IPG干膠條pH3-10L(180mm×3mm×0.5mm)去保護(hù)膜,膠面朝下,小心放入持膠槽,尖端在陽(yáng)極,平端在陰極。趕凈氣泡,用IPG覆蓋液封閉,防止樣品液蒸發(fā),蓋好持膠槽蓋子后置于IPGphor水平電泳儀(AmershamPharmaciaBiotech)電極板上,水化和等點(diǎn)聚焦在20℃條件下自動(dòng)進(jìn)行?？傠妷簽?0kVh,其中水化在30V,進(jìn)行16h,然后500V,1h;1000V,1h,最后穩(wěn)定在8000V下進(jìn)行。第二向SDS垂直電泳:等電聚焦后,迅速取出IPG膠條,分別于40ml平衡液A[1.5mol/LTris-HCl(pH6-8),6mol/Lurea,30%甘油,2%SDS(sodiumdodecylsulfate),0.2%DTT]和40ml平衡液B[1.5mol/LTris-HCl(pH6-8),6mol/Lurea,30%甘油,2%SDS,3%碘乙酰胺,痕量溴酚藍(lán)]中各平衡15min。將IPG膠條移至200mm×200mm×1.5mm,13%的均勻膠上方,排凈氣泡,用0.5%瓊脂糖(用電泳緩沖液Tris-Gly-SDS配制)封閉。12℃循環(huán)水冷卻,20mA恒流電泳,直至溴酚藍(lán)到達(dá)膠底邊時(shí)停止電泳。染色:凝膠染色采用考馬斯亮蘭第二向SDS電泳完畢,首先將凝膠用考馬斯亮蘭染色液(0.3%考馬斯亮蘭R250,50%甲醇,10%冰醋酸;39.7%H考馬斯亮蘭脫色后,用重蒸水淋洗10min,然后敏化液(400ml乙醇,20ml37%甲醛,2ml50%戊二醛,重蒸水定容至1000ml)處理5min,接著40%乙醇處理20min后,用0.6mmol/LNa蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)采用二維校正法(ID-Calibralion)確定。干膠制備:參考陳偉方法進(jìn)行2茶樹芽葉蛋白質(zhì)的分離純化方法1(參照人體細(xì)胞的蛋白質(zhì)提取和雙向電泳方法),茶樹芽葉蛋白質(zhì)的提取得率僅為5.2mg/gFW(圖1a),絕大部分蛋白質(zhì)已丟失。得到茶樹芽葉雙向電泳二維圖譜如圖2a所示,蛋白質(zhì)斑點(diǎn)較少,蛋白質(zhì)提取物含雜質(zhì)太多,對(duì)橫向和豎向干擾太大,蛋白質(zhì)斑點(diǎn)不能呈圓形或橢圓形。方法2(參照水稻的蛋白質(zhì)提取和雙向電泳方法),茶樹芽葉蛋白質(zhì)的提取得率僅為10.3mg/gFW(圖1b),已丟失大量蛋白質(zhì)。得到茶樹芽葉雙向電泳二維圖譜如圖2b所示,蛋白質(zhì)斑點(diǎn)最少,蛋白質(zhì)組分不能有效地分離,且不能均勻地分布在電泳凝膠上。方法3(參照荔枝的蛋白質(zhì)提取和雙向電泳方法),茶樹芽葉蛋白質(zhì)的提取得率有所提高,為25.5mg/gFW(圖1c),雙向電泳二維圖譜如圖2c所示,分布均勻程度有所改善,但是仍有許多蛋白質(zhì)組分未能有效分離,且橫向和豎向干擾較大。方法4,茶樹芽葉蛋白質(zhì)的提取得率高達(dá)33.7mg/gFW(圖1d),在雙向電泳二維圖譜(圖2d)上,蛋白質(zhì)組分得到有效分離,斑點(diǎn)可達(dá)500多個(gè),且比較均勻地分布在凝膠上,蛋白質(zhì)樣品的雜質(zhì)大大減少,大多數(shù)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)呈圓形或橢圓形,清晰可見,分離出的各蛋白質(zhì)組分基本上沒有拖尾、紋理和橫向擴(kuò)散。本試驗(yàn)結(jié)果表明,茶樹芽葉蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量約在14.0kD~100.0kD范圍內(nèi),主要分布在14.0kD~67.0kD之間。等電點(diǎn)約在4~9.5范圍內(nèi),主要分布在4~6.5。3蛋白質(zhì)應(yīng)用程序改良方法實(shí)驗(yàn)表明,方法1,方法2,方法3,皆未能適合茶樹材料。方法4即改進(jìn)后的蛋白質(zhì)提取和雙向電泳方法能適用于茶樹蛋白質(zhì)組研究。筆者將此方法應(yīng)用于茶樹外源誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)組分析,結(jié)果表明,該方法具有很好的重復(fù)性和穩(wěn)定性,并分離出5個(gè)特異蛋白質(zhì)組分。該改良方法是針對(duì)茶樹材料特性,綜合了前人的研究結(jié)果,并進(jìn)行了如下技術(shù)改進(jìn):(1)蛋白質(zhì)提取:用液氮研磨,同時(shí)加入PVP和DTT,并用預(yù)冷丙酮[含0.07%(V/V)β-Me]反復(fù)沉淀數(shù)次,直至色素完全去除干凈;樣品與丙酮的比例(V/V)由1:4提高到1:6~8。(2)IEF電泳:蛋白質(zhì)的裂解與水化分別吸取了方法1和方法3的優(yōu)點(diǎn),用方法3的裂解液,用方法1的水化液,并將二者有機(jī)結(jié)合。同時(shí),裂解液的兩性電解質(zhì)載體增加了兩種pH范圍(pH4~7,pH6~9),它們的總量在裂解液中比例由2.5%降低至0.5%;水化液中添加0.5%的TritonX-100。(3)SDS電泳:提高平衡液總量,使凝膠與平衡液體積比由1:10提高到1:20。(4)染色:將單一的染色方法改為考馬斯亮蘭染色和銀染相結(jié)合,并對(duì)銀染方法稍作改進(jìn),縮短時(shí)間,提高銀染效果。本研究發(fā)現(xiàn)一種辨別茶樹蛋白質(zhì)樣品質(zhì)量好壞的簡(jiǎn)便方法。含茶樹芽葉蛋白質(zhì)樣品的裂解液與水化液充分混合后,若出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象(即使渾濁在若干分鐘后有可能會(huì)自動(dòng)消失),說明蛋白質(zhì)樣品含有雜質(zhì),勢(shì)必干擾雙向電泳,須重新制備樣品。兩性電解質(zhì)載體(Ampholine)是等電聚焦的關(guān)鍵試劑實(shí)驗(yàn)表明,該改良方法適用于茶樹的蛋白質(zhì)組研究。但存在一個(gè)普遍性問題:方法1可分離出人體細(xì)胞蛋白質(zhì)斑點(diǎn)1200個(gè)左右,方法2可分離出水稻蛋白質(zhì)斑點(diǎn)700個(gè)左右,