uflc-msms法同時(shí)測(cè)定當(dāng)歸中的農(nóng)藥殘留

uflc-msms法同時(shí)測(cè)定當(dāng)歸中的農(nóng)藥殘留

當(dāng)歸（oliv.）是波形科的一種藥物，屬于多年生草本植物?，F(xiàn)代藥理和臨床研究表明,當(dāng)歸對(duì)多種疾病特別是心血管系統(tǒng)疾病有很好的療效,同時(shí)具有抗腫瘤、改善肺功能、提高免疫力等藥理活性。近年來由于當(dāng)歸種植面積擴(kuò)大,病害逐年加重農(nóng)藥多殘留分析需解決的主要問題之一是去除共提取基質(zhì)干擾物對(duì)定量準(zhǔn)確度、靈敏度及儀器污染的影響。因此,樣品前處理中對(duì)基質(zhì)凈化方法的選擇及優(yōu)化是多殘留檢測(cè)的關(guān)鍵。固相萃取技術(shù)具有吸附容量大、凈化效果好、易與檢測(cè)儀器聯(lián)用等優(yōu)點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于中藥材農(nóng)藥多殘留分析傳統(tǒng)的儀器檢測(cè)方法,如氣相色譜法(GC)、液相色譜法(HPLC),難以消除復(fù)雜基質(zhì)的干擾。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)雖在中藥材農(nóng)藥殘留檢測(cè)方面做出很大的貢獻(xiàn),如程志等本文對(duì)固相萃取前處理方法中提取和凈化步驟進(jìn)行了優(yōu)化和評(píng)估,結(jié)合靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)的LC-MS/MS技術(shù),以基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)法一次進(jìn)樣即可完成當(dāng)歸藥材中多類別農(nóng)藥殘留的定性、定量分析,并應(yīng)用于實(shí)際樣品的分析檢測(cè)。該方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、應(yīng)用廣的特點(diǎn),對(duì)當(dāng)歸藥材的安全監(jiān)測(cè)有重要的意義。1實(shí)驗(yàn)部分1.1儀器、檢測(cè)和分析QTRAP5500質(zhì)譜儀,配有電噴霧離子源、三重四極桿-線性離子阱質(zhì)量分析器及Analyst1.6.2工作站(美國(guó)ABSCIEX公司)、MultiQuant3.0.2數(shù)據(jù)處理軟件;LC-30ADUFLC液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司)。乙腈為色譜純(德國(guó)Merck公司);無(wú)水硫酸鎂為優(yōu)級(jí)純(Sigma-Aldrich);醋酸鈉為分析純(天津市化學(xué)試劑一廠);PSA固相萃取柱(500mg/6mL)、CARB固相萃取柱(500mg/6mL)、CARB/NH135種農(nóng)藥及其代謝物、內(nèi)標(biāo)d中藥材樣品(10批當(dāng)歸),產(chǎn)地為甘肅,由天津天士力中藥資源有限公司提供。1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:取各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品10mg(精確至0.001mg),分置于10mL量瓶中,用乙腈溶解并稀釋至刻度,制成質(zhì)量濃度為1.0g/L的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,儲(chǔ)存于4℃冰箱中,備用?；旌蟽?chǔ)備液:分別準(zhǔn)確吸取適量單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用0.05%(v/v)乙酸乙腈溶液定量稀釋,制成各農(nóng)藥組分質(zhì)量濃度均為1.0mg/L的混合儲(chǔ)備液,于-20℃冰箱中保存。內(nèi)標(biāo)溶液:取d標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:準(zhǔn)確吸取系列體積的混合儲(chǔ)備液,分置于5mL量瓶中,各加入內(nèi)標(biāo)溶液50μL,用乙腈稀釋至刻度,制成質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、20、50、80μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液?；|(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液:按照1.3節(jié)步驟提取不含目標(biāo)化合物的“空白”樣品,將獲得的提取液作為稀釋溶劑,按照上述“標(biāo)準(zhǔn)工作溶液”的配制,制成相同濃度梯度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。1.3硫酸鎂-醋酸鈉體系稱取當(dāng)歸藥材粉末2g(精確至0.01g),置于50mL離心管中,準(zhǔn)確加入內(nèi)標(biāo)溶液100μL、水10mL,浸潤(rùn)30min后,準(zhǔn)確加入乙腈10mL,于渦旋混合振蕩儀振蕩(5000r/min)2min,向離心管中加入無(wú)水硫酸鎂4g和醋酸鈉1g,手動(dòng)振搖5min,離心(5000r/min)5min。取上清液1mL,加至預(yù)先用乙腈-甲苯(20∶1,v/v)5mL活化的固相萃取小柱中,用乙腈-甲苯(20∶1,v/v)20mL分4次淋洗小柱,合并洗脫液,在38℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干,用乙腈1mL溶解殘?jiān)?經(jīng)0.22μm濾膜過濾,濾液作為供試溶液。1.4ufc-ms條件1.4.1萃取條件和梯度洗脫程序色譜柱:AcquityHSST3柱(100mm×2.1mm,1.8μm,Waters公司);流動(dòng)相:0.1%(v/v)甲酸水溶液(A)和乙腈(B);流速:0.3mL/min;梯度洗脫程序:0~1.0min,95%A;1.0~4.0min,95%A~40%A;4.0~14.0min,40%A~0%A;14.0~15.0min,0%A;15.0~18.0min,95%A。1.4.2風(fēng)速msm模式離子源:電噴霧離子(ESI)源;掃描方式:正離子掃描;檢測(cè)方式:依賴保留時(shí)間的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(scheduledMRM)模式;離子化電壓(IS):5500V;霧化溫度(TEM):550℃;氣簾氣壓力(CUR):241.3kPa(35psi);噴霧氣壓力(Gas1):379.3kPa(55psi);輔助加熱氣壓力(Gas2):379.3kPa(55psi);碰撞氣壓力(CAD):中等(medium)。2結(jié)果與討論2.1農(nóng)藥種類的選擇本研究根據(jù)農(nóng)藥的理化性質(zhì),依據(jù)GB/T20769-2008,并參考美國(guó)、歐盟等國(guó)家和組織2.2流動(dòng)相的優(yōu)化采用MS-only模式,直接進(jìn)樣方式,對(duì)單一化合物逐個(gè)進(jìn)行優(yōu)化。首先進(jìn)行Q1全掃描,識(shí)別目標(biāo)物的母離子,參考?xì)W盟指令(2002/657/EC)為了保證各農(nóng)藥化合物具有良好峰形以及足夠的靈敏度,本文考察了乙腈-水、乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液、乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液(含5mmol/L甲酸銨)以及乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液(含10mmol/L甲酸銨)4種流動(dòng)相體系。甲酸的加入,可促進(jìn)化合物的離子化2.3樣品預(yù)處理方法的優(yōu)化2.3.1水用量對(duì)提取效果的影響由于中藥材含水量較少,直接使用有機(jī)溶劑難以有效提取待分析物。因此需加入一定量的水,以確保樣品中的待分析物較容易地被提取出來。稱取藥材2g,分別加入水5、10和15mL,靜置30min。結(jié)果顯示,5mL水不能使藥材完全浸潤(rùn),而15mL水量過多,影響液-液分配效率,降低回收率。因此,最終確定中藥材取樣量為2g,添加水量為10mL。2.3.2凈化方法的選擇農(nóng)藥殘留檢測(cè)前處理中常用的提取劑有乙腈、丙酮、乙酸乙酯等,本文分別從凈化效果、提取回收率兩方面考察了這3種溶劑對(duì)135種農(nóng)藥及其代謝物的提取情況。從凈化效果(見圖1)看,乙酸乙酯由于對(duì)水的溶解度較低,極性干擾物不易被同時(shí)提取;丙酮極性較大,且與水互溶,易將水溶性的極性干擾物(如色素)一并提取出來,使后續(xù)的凈化步驟難度加大,導(dǎo)致其重復(fù)性較差;3者的凈化效果依次為乙酸乙酯>乙腈>丙酮。對(duì)135種農(nóng)藥及其代謝物在0.1mg/kg濃度水平下進(jìn)行了添加回收試驗(yàn),圖2顯示,乙酸乙酯無(wú)法從含水基質(zhì)中完全萃取出極性較大的農(nóng)藥;與丙酮和乙酸乙酯比較,乙腈適合的農(nóng)藥極性范圍相對(duì)廣泛,是一種較為適宜的提取溶劑;3者的提取效率依次為乙腈>丙酮>乙酸乙酯。綜合考慮,本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈為提取溶劑。2.3.3從宏觀上實(shí)現(xiàn)有機(jī)相的分配在提取液中加入硫酸鎂作為脫水劑能有效減小水相的體積,從而促進(jìn)分配于水相的極性分析物再分配進(jìn)入有機(jī)相,以獲得高回收率。但是同時(shí)考慮到提取的選擇性,在采用硫酸鎂分離的同時(shí),通過改變添加到樣品中的鹽,可以控制該方法的極性范圍2.3.4spe柱的選擇固相萃取方法中常用的SPE小柱有PSA、NH2.3.5洗衣粉和洗滌劑的選擇參考文獻(xiàn)2.3.6對(duì)濃縮溫度的研究實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),洗脫液的濃縮溫度是影響熱不穩(wěn)定農(nóng)藥回收率的主要因素,如敵百蟲在一定溫度下會(huì)降解生成三氯乙醛、磷酸二甲酯和敵敵畏2.4方法學(xué)的檢驗(yàn)2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制將1.2節(jié)配制的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣,以各組分定量離子的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(y)對(duì)各組分質(zhì)量濃度(x,μg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,采用最小二乘法得回歸方程y=a+bx。135種農(nóng)藥及其代謝物在當(dāng)歸藥材基質(zhì)中的響應(yīng)值與其濃度均呈良好的線性關(guān)系,在相應(yīng)的濃度范圍之內(nèi),135種農(nóng)藥及其代謝物的線性相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.99。定量限(LOQ)是指在可接受的準(zhǔn)確度和精密度下,能夠定量測(cè)定的樣品中待測(cè)成分的最低量或濃度2.4.2基質(zhì)形成檢測(cè)基質(zhì)效應(yīng)(matrixeffect,ME)是指樣品中除分析物以外的組分對(duì)分析物的離子化產(chǎn)生增強(qiáng)或抑制作用,ME影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。本文采用以下公式評(píng)價(jià)ME:試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),不同農(nóng)藥在當(dāng)歸基質(zhì)中的ME不同。如圖5所示,50多個(gè)農(nóng)藥在當(dāng)歸藥材中產(chǎn)生明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)(ME<70%)。用以補(bǔ)償ME的方法有:基質(zhì)凈化法、同位素內(nèi)標(biāo)法、空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和加入分析保護(hù)劑等。內(nèi)標(biāo)法不僅可以對(duì)ME進(jìn)行校正、保證回收率,而且可對(duì)樣品處理過程中的變化進(jìn)行校正,有利于方法的穩(wěn)定性。但對(duì)多種類農(nóng)藥同時(shí)檢測(cè)時(shí),由于存在極性差異,即使是同類物質(zhì)的同位素內(nèi)標(biāo)也很難抵消ME,造成定量結(jié)果偏差。而基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液法是按照樣品前處理步驟提取不含目標(biāo)化合物的“空白”樣品,將提取液作為溶劑,配制成標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。因此,在LC-MS/MS多殘留分析中采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線-內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行校準(zhǔn)定量能較好地補(bǔ)償ME。2.4.3添加水平的選擇本文采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線-內(nèi)標(biāo)法定量,在無(wú)農(nóng)藥殘留的當(dāng)歸空白基質(zhì)中添加135種農(nóng)藥及其代謝物進(jìn)行回收率試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取藥材粉末2g,置于50mL離心管中,添加水平分別為10、50和100μg/kg,按照1.3節(jié)所述的步驟進(jìn)行樣品前處理,每個(gè)添加水平重復(fù)6次。3個(gè)添加水平下,除了烯草酮回收率偏低(62.0%~68.2%),其余農(nóng)藥的平均回收率為71.3%~119.7%,RSD為1.0%~19.9%,數(shù)據(jù)表明該方法的精密度和回收率都比較好,符合殘留檢測(cè)有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)的要求。2.5定性離子的相對(duì)豐度參考GB/T20769-2008,陽(yáng)性結(jié)果的確證依據(jù)為:樣品中待測(cè)物的保留時(shí)間與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間偏差在±0.2min以內(nèi);同時(shí)樣品中各農(nóng)藥定性離子的相對(duì)豐度與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品定性離子的相對(duì)豐度必須符合下述標(biāo)準(zhǔn):相對(duì)豐度大于50%,偏差在±10%;相對(duì)豐度為20%~50%,偏差在±20%;相對(duì)豐度小于10%,偏差在±50%。2.6農(nóng)藥殘留檢出率應(yīng)用所建立的分析方法對(duì)10批當(dāng)歸樣品進(jìn)行農(nóng)藥的快速篩查。根據(jù)2.5節(jié)所述定性依據(jù),以保留時(shí)間、離子對(duì)比率進(jìn)行定性分析,以定量離子對(duì)進(jìn)行定量分析。在6批藥材中檢出農(nóng)藥殘留,檢出率高達(dá)60%。檢出的農(nóng)藥有多菌靈、甲拌磷、莠去津、烯唑醇,含量依次為0.010~0.020mg/kg、0.018~0.051mg/kg、0.012~0.018mg/kg、0.015~0.049mg/kg,其中甲拌磷和烯唑醇超出歐盟