spo0a基因缺失對bclausii發(fā)酵生產(chǎn)性能的影響

spo0a基因缺失對bclausii發(fā)酵生產(chǎn)性能的影響

克林威治轉(zhuǎn)化菌是一種厭氧菌，具有良好的耐藥性，可以在極端環(huán)境中生長。近年來,芽孢形成及萌發(fā)過程中關鍵基因的研究目前國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),spo0A基因缺失對枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、梭狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)等多種芽孢桿菌的芽孢生成均產(chǎn)生有效的抑制作用1材料和方法1.1材料和試劑1.1.1siiql-1質(zhì)粒及ph值1的水siiql-1hta1克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)QL-1、含pHT01質(zhì)粒的大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109:山東省微生物工程重點實驗室保存。1.1.2試劑與試劑盒限制性核酸內(nèi)切酶:大連TakaRa公司;氯霉素、Ezup柱式基因組脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid,DNA)抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒:生工生物工程(上海)有限公司;高純度質(zhì)粒小量快速抽提試劑盒:北京艾德萊生物科技有限公司;其他試劑均屬于國產(chǎn)分析純。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。1.1.3蛋白/淀粉法LB培養(yǎng)基:酵母浸粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉10g/L、pH7.0?？扇苄缘矸叟囵B(yǎng)基:牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉5g/L、可溶性淀粉2g/L、pH7.0~7.2、瓊脂20g/L。菌體增殖培養(yǎng)基:酵母浸粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉10g/L、山梨醇91g/L。菌體復蘇培養(yǎng)基:酵母浸粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉10g/L、山梨醇69g/L、甘露醇91g/L。上述培養(yǎng)基均于121℃滅菌20min。1.2pcr和u3000酸SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺:蘇州凈化設備有限公司;WFJ7200型可見分光光度計:尤尼柯(上海)儀器有限公司;4380C型電轉(zhuǎn)儀、5804R低溫冷凍離心機:德國Eppendorf公司;GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱:上海精宏實驗設備有限公司;Veriti96孔熱循環(huán)梯度聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction,PCR)儀:美國應用生物系統(tǒng)公司;MD2000核酸超微量分光光度計:美國BioFure公司;ZQYZ-CS型恒溫振蕩培養(yǎng)箱:上海知楚儀器有限公司;DYY-12電泳儀:北京市六一儀器廠;UVIEssentialV6凝膠成像儀:英國Uvitec公司。1.3實驗方法1.3.1引用設計采用Oligo軟件設計引物,引物信息見表1。1.3.2b.clausiiql-1菌體基因組的提取同源重組片段spo0A-Cmspo0A基因的調(diào)取:挑取B.clausiiQL-1單菌落轉(zhuǎn)接于50mLLB液體培養(yǎng)基,37℃,200r/min培養(yǎng)12h,使用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒對B.clausiiQL-1菌體基因組進行提取。1μL基因組模板、1μLspo0AF和1μLspo0AR引物、12.5μL2×HiFi-PCRmaster、9.5μLddH片段Cm同源重組片段spo0A-Cm1.3.3同源重組片段spo0a-cm采用限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ對所得的spo0A-Cm1.3.4b.clausiiql-1單菌落與b.clausiiql-111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111電轉(zhuǎn)緩沖液配制:山梨醇91g/L、甘露醇91g/L、甘油100g/L。將B.ClausiiQL-1單菌落接種于15mL的LB液體培養(yǎng)基中,37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)12h;將上述菌液以2%接種量轉(zhuǎn)接到50mLLB培養(yǎng)基中,37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)至OD1.3.5氯霉素的溶解25mg/mL氯霉素的制備:準確稱取氯霉素溶解于無水乙醇,溶解后過0.22μm濾膜過濾除菌,分裝后于-20℃中保存。感受態(tài)與spo0A-Cm1.3.6陽性重組菌株的鑒定以提取到的陽性菌株DNA為模板,spo0AF和Cm1.3.7l-1spo0a菌液接種時間將菌株B.clausiiQL-1與B.clausiiQL-1△spo0A分別以2%接種量接種于LB液體培養(yǎng)基,37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)28h,將菌液于80℃水浴處理10min。將80℃水浴處理過的出發(fā)菌株菌液稀釋101.3.8spo0a生長周期測定生長曲線的繪制:挑取菌株B.clausiiQL-1與B.clausiiQL-1△spo0A單菌落于15mLLB液體培養(yǎng)基,37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)12h,將菌液轉(zhuǎn)接至100mLLB液體培養(yǎng)基至初始OD生物量的測定:每隔12h取樣10mL,離心得菌體沉淀,于70℃烘箱烘干至恒質(zhì)量后測其生物量。1.3.9淀粉酶酶活測定分別將出發(fā)菌株B.clausiiQL-1和重組菌株B.clausiiQL-1△spo0A單菌落點涂于可溶性淀粉平板中央,于37℃條件下靜置培養(yǎng)36h,觀察并比較透明圈大小。分別以2%接種量接種在LB液體培養(yǎng)基中,37℃、200r/min振蕩培養(yǎng),每隔6h取樣5mL,4℃、12000r/min離心8min取上清,按照國標GB/T24401—2009《α-淀粉酶制劑》中所示方法測定淀粉酶酶活,并按干質(zhì)量進行換算為U/g。淀粉酶酶活定義:于60℃、pH值為6.0條件下,1h液化1g可溶性淀粉的酶量,即為一個酶活力單位(U/g)。2結(jié)果與分析2.1spo0a片段的pcr擴增以B.clausiiQL-1出發(fā)菌基因組為模板,spo0AF和spo0AR為引物進行PCR擴增,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果見圖2a。由圖2a可知,擴增產(chǎn)物大小為500bp左右,與理論長度418bp相符,說明成功獲得spo0A片段;以質(zhì)粒pHT01為模板,Cm通過連續(xù)傳代15次,以Cm2.2成孢條件的比較通過平板計數(shù)法對出發(fā)菌株及重組菌株芽孢生成情況進行計算及比較,結(jié)果見圖4。由圖4可知,菌株B.clausiiQL-1芽孢萌發(fā)數(shù)為3.93×102.3b.clausiiql-1spo0a重組菌生長周期對出發(fā)菌株B.clausiiQL-1及重組菌株B.clausiiQL-1△spo0A進行了生長規(guī)律分析及生物量測定,結(jié)果見圖5。由圖5a可知,B.clausiiQL-1△spo0A菌株與出發(fā)菌株的生長周期基本保持一致,4~18h為對數(shù)生長期,18~28h為穩(wěn)定期,28h后進入衰亡期。由圖5b可知,在任何時間段,重組菌株B.clausiiQL-1△spo0A生物量均高于出發(fā)菌株B.clausiiQL-1,且均在20h出現(xiàn)最大生物量,分別為3.10mg/mL、2.50mg/mL,生物量提高了24%。2.4最佳水泥砂漿發(fā)酵培養(yǎng)菌株的確定可溶性淀粉平板初篩,重組菌株B.clausiiQL-1△spo0A較出發(fā)菌株B.clausiiQL-1透明圈增大,重組菌株透明圈與菌落直徑比為2.75,出發(fā)菌株透明圈與菌落直徑比為1.31,說明構(gòu)建菌株較出發(fā)菌株水解淀粉能力更強。進一步于LB液體培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)并測定淀粉酶酶活,結(jié)果見圖6。由圖6可知,重組菌株B.clausiiQL-1△spo0A產(chǎn)淀粉能力高于出發(fā)菌株B.clausiiQL-1菌株,且發(fā)酵至72h時,淀粉酶酶活均達到最高,分別為1.58×103spo0a基因缺失型菌株的構(gòu)建本實驗室通過同源單交換技術成功實現(xiàn)了克勞氏芽孢桿菌spo0A基因的敲除,構(gòu)建了spo0A基因缺失型菌株B.clausiiQL-1△spo0A,并對其發(fā)酵性能進行初步研究,發(fā)現(xiàn)spo0A基因缺失型菌株不生成芽孢,且較出發(fā)菌株B.clausiiQL-1生物量提高24%,表明spo0A基因不僅是克勞氏芽孢桿菌芽孢形成關鍵基因,而且也是