第4章藥物定量分析與分析方法驗(yàn)證

第四章藥物定量分析與分析方法驗(yàn)證

石河子大學(xué)藥學(xué)院

基本要求

一、掌握體外樣品分析前處理方法二、掌握體內(nèi)樣品分析前處理方法三、了解定量分析樣品的前處理方法的進(jìn)展及在藥物分析中的應(yīng)用

第一節(jié)概述為什么要對(duì)定量分析的樣品進(jìn)行前處理？常規(guī)藥物的主藥，輔料新劑型藥物的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，微球骨架中藥制劑的復(fù)雜組成生物藥物濃度低，含有蛋白質(zhì)等內(nèi)源性物質(zhì)減少干擾，提高靈敏度，專(zhuān)屬性，準(zhǔn)確度

第一節(jié)

定量分析樣品的前處理方法

一、概述

1.不同結(jié)構(gòu)的樣品

鹵素與芳環(huán)結(jié)合

含鹵素有機(jī)藥物

R-X（F，Cl,Br,I）鹵素與脂肪鏈碳原子結(jié)合

含金屬有機(jī)藥物R-O-Me（有機(jī)酸或酚含金屬有機(jī)藥物金屬鹽；結(jié)合不牢固）

有機(jī)金屬藥物R-Me

（結(jié)合牢固）

常用的處理方法不經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法含鹵素有機(jī)藥物系指藥物分子結(jié)構(gòu)中所含鹵素直接與芳環(huán)或脂肪鏈相連者，而不包括某些有機(jī)藥物的鹵酸鹽或氫鹵酸鹽。結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：C—X（一）鹵原子的活潑性1.鹵原子與碳原子直接相連，鹵原子的活潑性和它直接相連的烴基的結(jié)構(gòu)有很大關(guān)系（1）乙烯型鹵和芳鹵不活潑（2）烯丙型鹵和芐鹵活潑（3）鹵代烷型介于兩者之間2.分子中所含鹵原子的個(gè)數(shù)分子中所含鹵原子的個(gè)數(shù)越多，活潑性越強(qiáng)，特別是同一碳上含多個(gè)鹵原子或一個(gè)苯環(huán)上含多個(gè)鹵原子時(shí)，活潑性增強(qiáng)更加明顯。二、不經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法（一）直接測(cè)定法例如葡萄糖酸鋅在水中溶解，直接釋放鋅離子。例如：富馬酸亞鐵

不溶于水，溶于熱稀礦酸，釋放亞鐵離子，采用鈰量法，鄰二氮菲作指示劑（紅色-藍(lán)色）（二）經(jīng)水解后測(cè)定法

1.用堿水解后測(cè)定法例如：三氯叔丁醇的含量測(cè)定

CCl3-C(CH3)2-OH+4NaOH(CH3)2CO+3NaCl+HCOONa+2H2ONaCl+AgNO3AgCl+NaNO3AgNO3+NH4SCNAgSCN+NH4NO3

△

原理三氯叔丁醇在氫氧化鈉溶液中加熱回流水解，氯元素全部轉(zhuǎn)變成氯化鈉，然后用剩余滴定法，即于水解液中加硝酸酸化，再加入定量過(guò)量的硝酸銀滴定液，使Cl-生成AgCl沉淀，過(guò)量的硝酸銀，以Fe3+為指示劑，用硫氰酸銨液回滴定。例:三氯叔丁醇的測(cè)定ChP（2000）（二）經(jīng)水解后測(cè)定法

2.用酸水解后測(cè)定法例如：硬脂酸鎂的含量測(cè)定

Mg(C17H35COO)2+H2SO4

MgSO4+2C17H35COOH

H2SO4+2NaOHNa2SO4

+2H2O

例

硬脂酸鎂的測(cè)定ChP（2000）取本品約0.1g，精密稱(chēng)定，精密加硫酸滴定液(0.05mol/L)50ml，煮沸至油滴澄清，繼續(xù)加熱10min，放冷至室溫，加甲基橙指示液1~2滴，用氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml硫酸滴定液(0.05mol/L)相當(dāng)于2.016mg的MgO。1.堿性還原后測(cè)定鹵素結(jié)合于芳環(huán)上時(shí),由于分子中碘的結(jié)合較牢固,需在堿性條件下加還原劑（如鋅粉）加熱回流，使結(jié)合的鹵素轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)機(jī)的鹵素離子，然后采用銀量法（Fajans法）測(cè)定。（三）經(jīng)氧化還原后測(cè)定法本法適用于測(cè)定結(jié)構(gòu)中碘與苯環(huán)直接相連，且一個(gè)苯環(huán)上含多個(gè)碘原子的含鹵素有機(jī)藥物。例泛影酸的測(cè)定ChP(2000)取本品約0.4g，精密稱(chēng)定，加氫氧化鈉溶液30ml與鋅粉1.0g，加熱回流30min，放冷，冷凝管用少量水洗滌，濾過(guò)，燒瓶與濾器用水洗滌3次，每次15ml，洗液與濾液合并，加冰醋酸5ml與曙紅鈉指示液5滴，用硝酸銀滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml硝酸銀滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于20.46mg的C11H9I3N2O4。

USP(24)、BP（1998）

ChP(2000)收載的膽影酸、碘番酸、膽影葡胺、泛影葡胺、碘他拉酸等均采用同法測(cè)定。（三）經(jīng)氧化還原后測(cè)定

2.酸性還原后測(cè)定例如：碘番酸的含量測(cè)定

醋酸酸性環(huán)境下，Zn還原后銀量法

有機(jī)破壞金屬原子，鹵素與碳原子結(jié)合牢固者，用上述方法很難將有機(jī)結(jié)合的金屬原子或者鹵素轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)的金屬化合物及鹵素化合物，必須采用有機(jī)破壞的方法將藥物分子破壞，將有機(jī)結(jié)合狀態(tài)的金屬，鹵素等轉(zhuǎn)變?yōu)榭蓽y(cè)定的無(wú)機(jī)化合物，方可選用合適的分析方法進(jìn)行測(cè)定。

三、經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法

HNO3-HClO4法(一)濕法破壞HNO3-H2SO4法

H2SO4-硫酸鹽法

HNO3-H2SO4-HClO4法；H2SO4-H2O2；H2SO4-KMnO4(二)干法破壞高溫?zé)胱品?/p>

氧瓶燃燒法加Na2CO3或MgO以助灰化；溫度控制在420℃

硫酸-硫酸鹽法：常用于含砷或銻有機(jī)藥物。硫酸鈉為含水化合物，不利于有機(jī)破壞，采用硫酸鉀。加入硫酸鹽，提高硫酸沸點(diǎn)，破壞完全，防止分解。破壞得到的無(wú)機(jī)金屬離子多為低價(jià)態(tài)！儀器：凱式燒瓶取樣：10g生物樣品：10-15ml尿樣：50ml(二)干法破壞

適用于濕法不易破壞完全的有機(jī)物以及某些不能用硫酸進(jìn)行破壞的有機(jī)藥物。不適用于含易揮發(fā)性金屬（如汞、砷等）有機(jī)藥物的破壞注意事項(xiàng)：（1）加熱或灼燒時(shí)，應(yīng)控制溫度在420℃以下（2）一定要灰化完全（3）經(jīng)本法破壞后，所得灰分往往不易溶解，但不要輕易棄去(三)氧瓶燃燒法（1）原理氧瓶燃燒法：將有機(jī)藥物放入充滿(mǎn)氧氣的密閉燃燒瓶中進(jìn)行燃燒，并將燃燒所產(chǎn)生的欲測(cè)物質(zhì)吸收于適當(dāng)?shù)奈找褐?，然后根?jù)欲測(cè)物質(zhì)的性質(zhì)，采用適宜的分析方法進(jìn)行鑒別、檢查或含量測(cè)定。適用于含鹵素、硫、氮、硒等有機(jī)藥物的分析本法特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速、破壞完全，尤其適用于微量樣品的分析（2）儀器與材料

①儀器裝置燃燒瓶為500、1000或2000ml無(wú)色、磨口、厚壁、硬質(zhì)玻璃錐型瓶；瓶塞空心，底部熔封鉑絲一根，下端呈螺旋狀或網(wǎng)狀②稱(chēng)樣用材料及稱(chēng)樣

A.固體樣品無(wú)灰濾紙

B.液體樣品紙袋

C.軟膏類(lèi)樣品：將適量樣品置不含被測(cè)成分的蠟油紙中包裹嚴(yán)密，外層再用無(wú)灰濾紙包裹④吸收液

A.作用：吸收液的作用是將樣品經(jīng)燃燒分解所產(chǎn)生的各種價(jià)態(tài)的鹵素、硫、氮、硒等，定量地吸收并轉(zhuǎn)變?yōu)橐欢ǖ谋阌跍y(cè)定的價(jià)態(tài)③氧氣B.吸收液的選擇氟水

氯NaOH溶液溴H2O2-NaOHNaOH-硫酸肼飽和溶液碘NaOH－硫酸肼飽和溶液硫NaOH或H2O2

硒硝酸溶液（3）操作方法①燃燒瓶燃燒前的準(zhǔn)備用洗液洗凈后，按各藥品項(xiàng)下的規(guī)定加入吸收液，將瓶口用水濕潤(rùn)，小心急速地通入氧氣1min，立即用表面皿覆蓋瓶口。②樣品的準(zhǔn)備取樣品適量，精密稱(chēng)定后按規(guī)定方法包裹，固定于鉑絲下端的網(wǎng)內(nèi)或螺旋處。③樣品的燃燒點(diǎn)燃包有供試品的濾紙尾部，迅速放入燃燒瓶中，按緊瓶塞，加水少量封閉瓶口，俟燃燒完畢（應(yīng)無(wú)黑色碎片），充分振搖，使生成的煙霧完全吸入吸收液中，放置15min，用水少量沖洗瓶塞及鉑絲，合并洗液及吸收液，同法另做空白試驗(yàn)。然后按各藥品項(xiàng)下規(guī)定的方法進(jìn)行鑒別、檢查或含量測(cè)定。①根據(jù)被燃燒分解的樣品量選用適宜大小的燃燒瓶。（4）注意事項(xiàng)

ChP（2000）規(guī)定的燃燒瓶體積為500、1000或2000ml三種，采用常量或半微量分析待分解樣品量燃燒瓶的體積

3~5mg（微量分析）

150~250ml

20~30mg（半微量分析）

300~500ml

50~60mg

1000ml

0.6~0.7g或更多

2000ml或特殊結(jié)構(gòu)的燃燒瓶正確選用燃燒瓶的目的在于：樣品能在足夠的氧氣中燃燒分解完全；有利于將燃燒分解產(chǎn)物較快地吸收到吸收液中；防止爆炸的可能性。②測(cè)定含氟有機(jī)藥物時(shí)，用石英制燃燒瓶③鉑絲燃燒時(shí)起催化作用④應(yīng)同時(shí)做空白試驗(yàn)⑤燃燒時(shí)要注意防爆⑥燃燒要完全⑦燃燒產(chǎn)生的煙霧完全被吸收例碘苯酯的含量測(cè)定ChP（2000）原理碘苯酯系有機(jī)碘化物，用氧瓶燃燒分解，轉(zhuǎn)變?yōu)榈饣铮^而氧化為游離的碘，并被定量地吸收于吸收液中，和氫氧化鈉反應(yīng)，生成碘化物與碘酸鹽，加入溴-醋酸溶液，使全部轉(zhuǎn)變?yōu)榈馑猁}，過(guò)量的溴以甲酸及通空氣去除。加入碘化鉀，使與碘酸鹽反應(yīng)析出游離碘，用硫代硫酸鈉液滴定，碘與淀粉結(jié)合所顯的藍(lán)色消失即為終點(diǎn)。（5）應(yīng)用應(yīng)用示例：碘苯酯的測(cè)定第二節(jié)定量分析方法特點(diǎn)

一、容量分析法（一）容量分析法的特點(diǎn)

操作簡(jiǎn)單、快速；比較準(zhǔn)確（RSD＜0.2%）；儀器普通易得。（二）容量分析法的計(jì)算問(wèn)題

1.滴定度（T）的概念每1ml規(guī)定濃度（mol/L）的滴定液所相當(dāng)?shù)谋粶y(cè)物質(zhì)的量(mg)。2.滴定度的計(jì)算aA+bBcC+dD

T=m×a/b×M

3.百分含量的計(jì)算（1）直接滴定法D%=V×F×T/W×100%

F=實(shí)際標(biāo)定的濃度/規(guī)定的濃度

（2）間接滴定法（回滴定法；剩余滴定法）

D%=（VO–VB)×F×T/W×100%

二、光譜分析法

（一）紫外-可見(jiàn)分光光度法（200nm～760nm)靈敏度高，可達(dá)10-4g/ml～10-7g/ml1.特點(diǎn)準(zhǔn)確度高，SRD（%）為2%～5%儀器價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)單，易普及，應(yīng)用范圍廣。2.朗伯-比耳定律A=ECLE1%1cm

的概念

3.儀器校正和檢定

波長(zhǎng)校正用汞燈中較強(qiáng)譜線(xiàn)237.38,253.65,275.28,296.73,313.16,334.15,365.02,404.66,425.83,546.07nm與576.96nm

或用儀器中氘燈的486.02nm與656.10nm進(jìn)行校正。吸收度的檢定：用K2CrO7(60mg)+0.005mol/LH2SO4液至1000ml

波長(zhǎng)(nm)235(最小)257(最大)313(最小)350(最大)

E1%1cm124.5144.048.62106.6

雜散光檢查：試劑濃度(g/ml)測(cè)定波長(zhǎng)透光率(%)

NaI1.00220nm＜0.8NaNO25.00340nm＜0.84.對(duì)溶劑的要求:使用范圍不得小于截止使用波長(zhǎng)。220～240nm241～250nm251～300nm300nm以上溶劑+吸收池A＜0.40＜0.20＜0.10＜0.05

5.測(cè)定方法要求供試品溶液的A應(yīng)在0.3～0.7對(duì)照品比較法：Cx=(Ax/Ar)Cr;含量%=Cx×D/W×100%

常用方法吸收系數(shù)法：含量%=(E1%1cm

)x/(E1%1cm

)r×100%

計(jì)算分光光度法（二）熒光分光光度法

靈敏度高，可達(dá)10-10g/ml～10-12g/ml

在低濃度進(jìn)行測(cè)定，防止F與C不成正比及自熄滅作用1.特點(diǎn)用基準(zhǔn)物溶液校正儀器靈敏度，防止樣品液熒光衰減靈敏度高，但干擾因素多。

制備熒光衍生物，可提高其靈敏度和選擇性。用樣品量少，操作簡(jiǎn)單，方法快速，應(yīng)用范圍較廣。

2.熒光分析儀有二個(gè)單色光器—激發(fā)單色光器與發(fā)射單色光器；且激發(fā)光源、樣品池和檢測(cè)器成直角。3.含量測(cè)定常用的方法對(duì)照品比較法:Ci=(Ri-Rib)/(Rr-Rrb)×Cr

Ch.P收載地高辛片、利血平片、洋地黃毒苷片。

三、色譜分析法

按分離原理分為：吸附；分配；離子交換；排阻色譜按分離方法分為：PC；TLC；柱色譜；GC；HPLC。（一）HPLC法1.對(duì)HPLC儀器一般要求色譜柱、流動(dòng)相按品種項(xiàng)下要求。色譜柱的理論板數(shù)：n=5.54(tR/Wh/2)22.系統(tǒng)性試驗(yàn)分離度：R=2（tR1–tR2)/(W1+W2);要大于1.5拖尾因子：T=W0.05h/2d1

應(yīng)在0.9～1.05

內(nèi)標(biāo)法加校正因子測(cè)定供試品中主成分含量3.測(cè)定方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法

外標(biāo)法測(cè)定供試品中主成分含量外標(biāo)一點(diǎn)法應(yīng)用示例：RP-HPLC法測(cè)定鹽酸黃酮哌酯片含量，用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法如頭孢拉??；頭孢羥氨芐；頭孢唑啉鈉用外標(biāo)一點(diǎn)法

（二）GC法1.對(duì)GC儀器一般要求載氣為氮?dú)?；色譜柱為填充或毛細(xì)管柱色譜柱的理論板數(shù)：n=5.54(tR/Wh/2)22.系統(tǒng)性試驗(yàn)分離度：R=2（tR1–tR2)/(W1+W2);要大于1.5拖尾因子：T=W0.05h/2d1

應(yīng)在0.9～1.05內(nèi)標(biāo)法加校正因子測(cè)定供試品中主成分含量

3.測(cè)定方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法

外標(biāo)法測(cè)定供試品中主成分含量外標(biāo)一點(diǎn)法應(yīng)用示例：Ch.P(2000)收載的月桂卓酮、維生素E及其片劑、注射劑、甲酚皂溶液等均采用GC法中的內(nèi)標(biāo)法加校正因子測(cè)定含量。

第三節(jié)藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證一、準(zhǔn)確度

是指用該方法測(cè)定結(jié)果與真實(shí)值接近的程度，用回收率表示（一）含量測(cè)定方法的準(zhǔn)確度1.原料藥可用已知純度對(duì)照品或樣品進(jìn)行測(cè)定；或與已建準(zhǔn)確度的另一方法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較。2.制劑要考察輔料對(duì)回收率的影響。采用在空白輔料中加入原料對(duì)照品的方法作回收率試驗(yàn)，然后計(jì)算RSD。

具體做法：測(cè)定高、中、低三個(gè)濃度，n=3,共9個(gè)數(shù)據(jù)來(lái)評(píng)價(jià)回收率的RSD＜2%；用UV和HPLC發(fā)時(shí)，一般回收率可達(dá)98%～102%；容量法可達(dá)99.7%～100.3%

（二）數(shù)據(jù)要求

回收率%=（測(cè)定平均值—空白值）/加入量×100%要求制備高、中、低三濃度的樣品，各測(cè)定3次。應(yīng)報(bào)告已知加入量的回收率，或測(cè)定結(jié)果平均值與真實(shí)值之差及其可信限。二、精密度

是指在規(guī)定的測(cè)試條件下，同一個(gè)均勻樣品，經(jīng)多次測(cè)定結(jié)果之間的接近程度。

（一）精密度表示方法1.偏差(deviation,d)d=測(cè)得值-平均值=Xi-X

2.標(biāo)準(zhǔn)偏差（standarddeviation,SD或S）

S=[(∑Xi–X)2/(n-1)]1/23.相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(relativestandarddeviation,RSD)也稱(chēng)變異系數(shù)(coefficientofvariation,CV)RSD=標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值×100%=S/X×100%（二）重復(fù)性、中間精密度及重現(xiàn)性1.重復(fù)性在相同條件下,由一個(gè)分析人員測(cè)定所得結(jié)果的精密度.2.中間精密度在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室，不同時(shí)間由不同分析人員用不同設(shè)備測(cè)定結(jié)果的精密度。3.重現(xiàn)性在不同實(shí)驗(yàn)室由不同分析人員測(cè)定結(jié)果的精密度。（三）數(shù)據(jù)要求

應(yīng)報(bào)告S或SD、RSD和可信限。用統(tǒng)計(jì)學(xué)的可信性分析(t或f）。

三、專(zhuān)屬性是指在其他成分(如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等)可能存在下，采用的方法能準(zhǔn)確測(cè)定出被測(cè)物的特性。鑒別反應(yīng)、雜質(zhì)檢查、含量測(cè)定方法，均應(yīng)考察其專(zhuān)屬性。

（一）鑒別反應(yīng)應(yīng)能與其它共存的物質(zhì)或相似化合物區(qū)分，不含被測(cè)組分的樣品均應(yīng)呈現(xiàn)負(fù)反應(yīng)。（二）含量測(cè)定和雜質(zhì)測(cè)定

色譜法和其他分離法，應(yīng)附代表性的圖譜，以說(shuō)明專(zhuān)屬性。

圖中應(yīng)注明各組分的位置，色譜法中分離度應(yīng)符合要求。在能獲得雜質(zhì)的情況下，可加到試樣中，考察對(duì)結(jié)果的干擾。在雜質(zhì)和降解物不能獲得的情況下，可用以驗(yàn)證方法和藥典方法進(jìn)行對(duì)照；也可用對(duì)試樣加速破壞的方法，比較兩種方法。四、檢測(cè)限（limitofdetection,

LOD)是指試樣中被測(cè)物能被檢測(cè)出的最低濃度或量，是限度檢驗(yàn)指標(biāo)。它無(wú)需測(cè)定，只要指出高于或低于該規(guī)定的濃度或量即可。（一）常用的方法

1.非儀器分析目視法用已知濃度被測(cè)物，試驗(yàn)出能被可靠地檢測(cè)出的最低濃度或量。2.儀器分析方法

UV法：LOD=f.3S空=C樣/A樣×

3S空

Flu法：LOD=f.3S空=C樣/(F樣-F空)×

3S空

GC和HPLC法：

LOD=S/N=2或3

（二）數(shù)據(jù)要求應(yīng)附測(cè)試圖，說(shuō)明測(cè)試過(guò)程和檢測(cè)限結(jié)果。

五、定量限（limitofquantitation,

LOQ)

是指樣品中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低量，其測(cè)定結(jié)果應(yīng)具一定準(zhǔn)確度和精密度。雜質(zhì)和降解產(chǎn)物進(jìn)行定量測(cè)定時(shí)，要求

LOQ.常用信噪比法確定定量限，一般以S/N=10時(shí)相應(yīng)的濃度進(jìn)行測(cè)定。

六、線(xiàn)性

是指在設(shè)定的范圍內(nèi)，測(cè)試結(jié)果與試樣中被測(cè)物濃度直接呈正比關(guān)系的程度。

UV法：首先制備一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)系列，濃度點(diǎn)n=5;A=0.3～0.7

建立回歸方程C=aA+b;r＞0.9999。HPLC法：制備一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)系列，濃度點(diǎn)n=5～7;以C對(duì)h或A或與內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比，建立回歸方程r＞0.9999。七、范圍

是指達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線(xiàn)性、測(cè)試方法適用的高低限度或量的區(qū)間。

原料藥和制劑含量測(cè)定：范圍應(yīng)為測(cè)試濃度的80%～120%。

制劑含量均勻度檢查：范圍應(yīng)為測(cè)試濃度的70%～130%。

溶出度或釋放度中的溶出量測(cè)定：范圍應(yīng)為限度的±20%。

八、耐用性

是指在測(cè)定條件下有效的變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的承受

程度。典型的變動(dòng)因素有：被測(cè)溶液的穩(wěn)定性、樣品提取次數(shù)、時(shí)間等。HPLC法變動(dòng)因素有：流動(dòng)相組成與pH，色譜柱，柱溫，流速等。

GC法變動(dòng)因素有：色譜柱，固定相，擔(dān)體、柱溫、進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度等。

分析方法效能指標(biāo)的具體應(yīng)用：1.用于鑒別試驗(yàn)的方法：只要求專(zhuān)屬性、耐用性，其余不要求。2.用于原料藥中雜質(zhì)測(cè)定和制劑中降解產(chǎn)物測(cè)定的方法：①用于定量：除了檢測(cè)限不要求外，其余七項(xiàng)指標(biāo)均要求。②限度檢查：除檢測(cè)限、專(zhuān)屬性、耐用性要求外，其余不要求。3.原料、制劑及溶出度測(cè)定：不要求檢測(cè)限和定量限，其余均要求。準(zhǔn)確度、精密度、專(zhuān)屬性、檢測(cè)限定量限、線(xiàn)性、范圍、耐用性練習(xí)與思考[A型題]

1．藥品的鑒別是證明A．未知藥物的真?zhèn)蜝．已知藥物的真?zhèn)蜟．已知藥物的療效D．藥物的純度E．藥物的穩(wěn)定性2．相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差表示的應(yīng)是A．準(zhǔn)確度B．回收率C．精密度D．純凈度E．限度3．用移液管量取的25ml溶液，應(yīng)記成A．25mlB．25.0mlC．25.00mlD．25.000mlE．25±1ml4．以下三個(gè)數(shù)字0.5362、0.0014、0.25之和應(yīng)為A．0.79B．0.788C．0.787D．0.7876E．0.85．表示兩變量指標(biāo)A與C之間線(xiàn)性相關(guān)程度常用A．相關(guān)規(guī)律B．比例常數(shù)C．相關(guān)常數(shù)D．相關(guān)系數(shù)E．精密度6．減小偶然誤差的方法是A．做空白試驗(yàn)B．做對(duì)照實(shí)驗(yàn)C．做回收試驗(yàn)D．增加平行測(cè)定次數(shù)E．選用多種測(cè)定方法[B型題]

1～4A．1.23B．1.22C．2.54D．2.53E．2.511．1.22522．2.53513．2.53484．2.5068ACDE

5～8A．空白試驗(yàn)B．對(duì)照試驗(yàn)C．回收試驗(yàn)D．鑒別試驗(yàn)E．檢測(cè)試驗(yàn)5．以同量的溶劑替代供試品同法進(jìn)行測(cè)定試驗(yàn)6．在供試液中加入已知量的標(biāo)準(zhǔn)物或已知量的被測(cè)物后，同法進(jìn)行測(cè)定試驗(yàn)7．用已知量的純物質(zhì)作為試樣，同法進(jìn)行測(cè)定試驗(yàn)8．取少許水楊酸，加水溶解，加三氯化鐵試液，顯紫堇色ACDB[X型題]1．藥物分析方法的效能指標(biāo)有

A．檢測(cè)限B．耐用性C．準(zhǔn)確度D．專(zhuān)屬性E．代表性2．對(duì)藥物中雜質(zhì)進(jìn)行限量檢查時(shí)，要求所用的檢查方法應(yīng)具有

A．耐用性B．專(zhuān)屬性C．檢測(cè)限D(zhuǎn)．準(zhǔn)確度E．線(xiàn)性與范圍3．測(cè)定藥物片劑的溶出度或釋放度時(shí)，對(duì)所用測(cè)定方法應(yīng)要求

A.精密度B.定量限C.耐用性

D.回收率E.檢測(cè)限

4．系統(tǒng)誤差來(lái)源于

A．分析方法B．所用試劑

C．操作者D．所用儀器

E．工作環(huán)境

5．消除系統(tǒng)誤差的方法為

A．校正所用的儀器B．作對(duì)照實(shí)驗(yàn)C．做空白試驗(yàn)D．做預(yù)試驗(yàn)E．做回收試驗(yàn)6．以下所列儀器哪些使用前需進(jìn)行校正

A．滴定管B．量瓶C．量杯D．移液管E．碘量瓶7．中國(guó)藥典（2000年版）在正文部分的檢查項(xiàng)下應(yīng)包括

A．藥物的真?zhèn)蜝．有效性C．均一性D．純度要求E．安全性8．進(jìn)行藥品檢驗(yàn)時(shí)，要從大量樣品中取出少量樣品應(yīng)考慮取樣的

A．多樣性B．真實(shí)性C．代表性D．科學(xué)性E．可靠性9．用信噪比表示檢測(cè)限時(shí)，信噪比一般應(yīng)為

A．1∶1B．2∶1C．3∶1

D．4∶1E．5∶1

10．檢驗(yàn)報(bào)告應(yīng)有以下內(nèi)容

A．供試品名稱(chēng)B．外觀(guān)性狀

C．檢驗(yàn)結(jié)果、結(jié)論D．送檢人蓋章

E．報(bào)告的日期返回

第四節(jié)

生物樣品分析方法的基本要求

一、常用樣品的種類(lèi)、采集和貯張二、生物樣品分析前處理技術(shù)三、定量分析方法驗(yàn)證

在測(cè)定生物樣品中藥物及其代謝物時(shí)，一般要在測(cè)定前進(jìn)行樣品的前處理，即進(jìn)行分離、純化、濃集。

生物樣品包括各種體液和組織，常用是血液（血漿、血清、全血）、尿液、唾液。

一般具有以下特點(diǎn)

（1）樣品量少，濃度低

（2）干擾因素多

（3）藥物濃度隨取樣時(shí)間而變化，且個(gè)體差異較大。（一）血樣

血漿（plasma)和血清（serum)是最常用的生物樣品。

測(cè)定血中藥物濃度通常是指測(cè)定血漿或血清中的藥物濃度，而不是指含有血細(xì)胞的全血中的藥物濃度。

一般認(rèn)為，當(dāng)藥物在體內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)，血漿中藥物濃度與藥物在作用點(diǎn)的濃度緊密相關(guān)，即血漿中的藥物濃度反映了藥物在體內(nèi)（靶器官）的狀況，因而血漿濃度可作為作用部位藥物濃度的可靠指標(biāo)。1.取樣：

供測(cè)定的血樣應(yīng)能代表整個(gè)血藥濃度，因而應(yīng)待藥物在血液中分布均勻后取樣。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)，可直接從動(dòng)脈或心臟取血。

對(duì)于病人，通常采取靜脈血，有時(shí)根據(jù)血藥濃度和分析方法靈敏度。也可用毛細(xì)管采血。血樣采量一般為1-2ml2.制備：

血漿的制備將采取的血液置含有抗凝劑（如：肝素、草酸鹽等）的試管中，混合后，離心，分離血細(xì)胞，上清液即為血漿。

肝素是一種含硫酸鹽的粘多糖，常用其鈉鹽、鉀鹽，它能阻止凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶，從而抑制纖維蛋白原形成纖維蛋白。一般lml的全血需加0.1—0.2mg的肝素，加入血樣后立即輕輕旋搖，但勿太猛烈，以免導(dǎo)致血細(xì)胞破裂。

血清的制備血清是由血液中纖維蛋白原等影響下，室溫放置，血液凝結(jié)，剝?nèi)パ?，離心后上層澄清黃色液體，經(jīng)離心其量約為全血量的30％一50％。在室溫高時(shí)，血凝過(guò)程進(jìn)行得很快，宜在血凝后半小時(shí)內(nèi)分離血清。當(dāng)室溫低時(shí)，血凝過(guò)程較慢，可將血液置37℃溫度下加速血清析出。

血漿及血清中的藥物濃度測(cè)定值通常是相同的。全血也應(yīng)加入抗凝劑混勻，防止凝血。對(duì)大多數(shù)藥物來(lái)說(shuō)血漿濃度與紅細(xì)胞中的濃度成正比，所以測(cè)定全血也不能提供更多的數(shù)據(jù)。全血的凈化較血漿和血清麻煩，特別是溶血后，血色素等可能會(huì)給測(cè)定帶來(lái)影響。通常用血漿或者血清中藥物藥物濃度代替。3.特點(diǎn)：

血樣的采取量受到限制、間隔時(shí)間，采集方法：一般取1ml—2m1。用注射器、毛細(xì)管或微量采血管采取。血樣的采血時(shí)間間隔應(yīng)隨測(cè)定目的的不同而異。

采取血樣后，應(yīng)及時(shí)分離血漿或血清，并立即進(jìn)行分析。如不能立即測(cè)定時(shí)，應(yīng)完全密塞后保存，短期冷藏（4℃），長(zhǎng)期冷凍（-20℃）保存。（二）唾液

唾液的采集應(yīng)盡可能在刺激少的安靜狀態(tài)下進(jìn)行。一般在漱口后15min收集，采集10min。

采集后立即測(cè)量其除去泡沫部分的體積。放置后分為泡沫部分、透明部分及灰乳白色沉淀部分三層。分層后離心分離，取上清液作為藥物濃度測(cè)定的樣品。

可集中、單一部位采集。

唾液中含有粘蛋白，為阻止粘蛋白的生成，應(yīng)將唾液在4℃以下保存，解凍后攪勻后再用，否則會(huì)產(chǎn)生誤差。

優(yōu)點(diǎn)：可以不受時(shí)間和地點(diǎn)的限制，很容易地反復(fù)采集，采集時(shí)無(wú)痛苦無(wú)危險(xiǎn)；有些唾液中藥物濃度可以反映血漿中游離型藥物濃度。

例如：HPLC法測(cè)定唾液中依諾沙星。缺點(diǎn)：

唾液是各腺體分泌的的混合液體，其組成發(fā)生經(jīng)時(shí)變動(dòng)；因此，唾液中的藥物濃度與血漿中的游離型藥物濃度相比就容易變動(dòng)；

唾液中藥物濃度與血漿中藥物濃度的比值(S/P)只有少數(shù)藥物是恒定值；

有些與蛋白結(jié)合率較高的藥物，藥物在唾液中的濃度比血漿濃度低得多，需要高靈敏度的分析方法才能檢測(cè)；

對(duì)有些患者（如癲痛二昏迷）不能采集唾液樣品。（三）尿液

尿藥測(cè)定主要用于藥物劑量回收研究、尿清除率、生物利用度的研究。

體內(nèi)藥物清除主要是通過(guò)尿液排出，藥物可以原型（母體藥物）或代謝物及其綴合物（conjugates）等形式排出。

尿液主要成分是水、含氮化合物（其中大部分是尿素）及鹽類(lèi)。

尿液中藥物濃度較高，收集量可以很大，也方便，但尿液濃度通常變化較大，應(yīng)測(cè)定一定時(shí)間內(nèi)排入尿中藥物的總量，這就需要測(cè)定在規(guī)定時(shí)間內(nèi)的尿液體積及尿藥濃度，時(shí)間尿以外的尿不可能推斷全尿中藥物的排泄?jié)舛群退幬锟偭俊?/p>

測(cè)定尿中藥物的總量時(shí)，將一定時(shí)間內(nèi)（如8h，12h或24h等）排泄的尿液全部?jī)?chǔ)存起來(lái)，并記錄其體積，取其一部分測(cè)定藥物濃度，然后乘以尿量求得排泄總量。采集的尿液時(shí)，需用量筒準(zhǔn)確地測(cè)量?jī)?chǔ)尿量，并做好記錄。

缺點(diǎn)：尿液中藥物濃度與血藥濃度相關(guān)性差；受試者的腎功能正常與否直接影響藥物排泄，因而腎功能不良者不宜采集尿樣；嬰兒的排尿時(shí)間難于掌握；尿液不易采集完全并不易保存。

采集的尿樣應(yīng)立即側(cè)定。若收集24h的尿液不能立即測(cè)定時(shí)，應(yīng)加入防腐劑置冰箱中保存。常用防腐劑有：甲苯等，短時(shí)冷藏；長(zhǎng)時(shí)冷凍。二生物樣品分析其前處理技術(shù)

主要應(yīng)考慮生物樣品的種類(lèi)，被測(cè)定藥物的性質(zhì)和測(cè)定方法三個(gè)方面的問(wèn)題。

樣品的分離、純化技術(shù)應(yīng)該依據(jù)生物樣品的類(lèi)型。例如，血漿或血清需除蛋白，使藥物從蛋白結(jié)合物中釋出；唾液樣品則主要采用離心沉淀除去粘蛋白；尿液樣品常采用酸或酶水解使藥物從綴合物中釋出。

根據(jù)被測(cè)定藥物的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及藥理性質(zhì)、存在形式、濃度范圍等，采取相應(yīng)的前處理方法。

樣品前處理方法隨測(cè)定方法不同而不同，例如放射性免疫測(cè)定法具有較高的靈敏度和選擇性，初步除去主要干擾物質(zhì)之后即可直接測(cè)定，對(duì)于HPLC法為防止蛋白質(zhì)等雜質(zhì)沉積在色譜柱上，需要處理。

（一）去除蛋白質(zhì)

目的：

可使結(jié)合型的藥物釋放出來(lái)，以便測(cè)定藥物的總濃度；

去除蛋白質(zhì)也可預(yù)防提取過(guò)程中蛋白質(zhì)發(fā)泡，減少乳化的形成，以及可以保護(hù)儀器性能，延長(zhǎng)使用期限。去除蛋白質(zhì)方法：

1.加入與水相混溶的有機(jī)溶劑加入水溶性的有機(jī)溶劑，可使蛋白質(zhì)的分子內(nèi)及分子間的氫鍵發(fā)生變化而使蛋白質(zhì)凝聚，使與蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物釋放出來(lái)。常用的水溶性有機(jī)溶劑有：乙腈、甲醇等。含藥物的血漿或血清與水溶性有機(jī)溶劑的體積比為1:（1-3)時(shí)，就可以將90%以上的蛋白質(zhì)除去，采用超速離心機(jī)（10000r/min)離心便可將析出的蛋白質(zhì)完全沉淀。

2.加入中性鹽使溶液的離子強(qiáng)度發(fā)生變化。中性鹽能將與蛋白質(zhì)水合的水置換出來(lái)，從而使蛋白質(zhì)脫水而沉淀。

常用的中性鹽：飽和硫酸胺等。鹽析的方法與有機(jī)溶劑提取法常并用，藥物的回收率高。3.加入強(qiáng)酸

當(dāng)pH低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)以陽(yáng)離子形式存在，加入強(qiáng)酸，可與蛋白質(zhì)陽(yáng)離子形成不溶性鹽而沉淀。常用的強(qiáng)酸有：10%三氯醋酸等。

含藥物血清與強(qiáng)酸的比例為1:0.6混合，高速離心,就可除去蛋白質(zhì)，取上清液作為樣品。在酸性下分解的藥物不宜用本法除蛋白。

4.加入含鋅鹽及銅鹽的沉淀劑

當(dāng)pH高于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，金屬陽(yáng)離子與蛋白質(zhì)分子中帶陰電荷的羧基形成不溶性鹽而沉淀。常用的沉淀劑有：CUS04-Na2W04,ZnS04-NaOH等。含藥物血清與沉淀劑的比例為1:2混合，高速離心、分離后得上清液。5.酶解法

在測(cè)定一些酸不穩(wěn)定及蛋白結(jié)合牢的藥物時(shí)，常需用酶解法。最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素。

PH范圍很寬，使蛋白質(zhì)肽鍵降解，在50-60攝氏度具有最大活力。（二）綴合物的水解

尿中藥物多數(shù)呈綴合狀態(tài)。

含羥基、羧基、氨基和巰基的藥物?？膳c內(nèi)源性物質(zhì)葡萄糖醛酸形成葡萄糖醛酸苷綴合物；

含酚羥基、芳胺及醇類(lèi)藥物與內(nèi)源性物質(zhì)硫酸形成硫酸酯綴合物。

由于綴合物較原型藥物具有較大的極性，不易被有機(jī)溶劑提取，常用酸水解或酶水解的方法。酸水解時(shí)，可加入適量的鹽酸液。對(duì)于遇酸及受熱不穩(wěn)定的藥物，可以用酶水解法。常用葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶或葡萄糖醛酸苷酶一硫酸酯酶的混合酶。（三）分離、純化與濃集

1.液～液提取法（liquid-liquidextraction;LLE)多數(shù)藥物是親脂性的，在適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑中的溶解度大于在水相中的溶解度，而血樣或尿樣中含有的大多數(shù)內(nèi)源性雜質(zhì)是強(qiáng)極性的水溶性物質(zhì)。因而用有機(jī)溶劑提取一次即可除去大部分雜質(zhì)。

應(yīng)用本法時(shí)要考慮所選有機(jī)溶劑的特性、有機(jī)溶劑相和水相的體積及水相的pH值等。