廣西香港海鷗菌分子分型研究

廣西香港海鷗菌分子分型研究

香港海膽細菌是一種新發(fā)現(xiàn)的食源性病原體。屬于nase科。這是一種需要氧和同時厭氧的新植物。hku1植物是這種植物的模型。香港海鷗菌最早的報道見于2001年,由香港大學(xué)從一名來自中國大陸的患有肝硬化的病人血液和胸腔膿汁中分離出1材料和方法1.1來源：蘑菇7株香港海鷗菌分離于2005年廣西水產(chǎn)品香港海鷗菌監(jiān)測采樣,沙門菌標準株H9812為深圳市CDC饋贈。1.2kemwell等API20NE鑒定卡(生物梅里埃生產(chǎn)),限制性內(nèi)切酶NotⅠ(Takara公司生產(chǎn)),SeaKemGold(CAMBREX公司生產(chǎn)),蛋白酶K(MERCK公司生產(chǎn)),細胞懸浮液(CSB)、細胞裂解液、酶切反應(yīng)體系、10×TBE等試劑自配。酶切反應(yīng)體系按每塊膠200μl準備,每200μl酶切反應(yīng)體系含純水175μl,BufferH20μl,NotⅠ30U,酶切緩沖液不含酶,其余成分相同。1.3蛋白凝膠成像系統(tǒng)CHEFMAPPERI脈沖場電泳儀(美國Bio-Rad公司)、BVO-PRLNT凝膠成像系統(tǒng)(Vilerber公司)、BioMerieuxVitekcolorimeter(生物梅里埃)。1.4方法1.4.1蛋白酶k的制備取5～5.5麥氏單位CSB菌懸液400μl于1.5ml離心管中,置37℃水浴5min,加入蛋白酶K混勻。加入400μl溶化的1%SeakemGlod:1%SDS,混勻后加入模具,放室溫10～15min凝固。1.4.2酶k終濃度為0.0.0m的聚丙烯螺口蓋管將制好的膠塊加入含5ml蛋白酶K/CLB混合液(蛋白酶K終濃度為0.1mg/ml)50ml的聚丙烯螺口蓋管中,54℃水浴搖床中孵育3h。用純水洗滌2次,TE重復(fù)洗3次,加入5～10mlTE放在4℃保存?zhèn)溆谩?.4.3sakimwell電泳切取2.0～2.5mm寬的膠塊,加入200μl含NotⅠ的酶切反應(yīng)體系,孵育2h。將膠塊放入1%SeakemGold膠塊孔中,電泳。電泳液2.2L0.5×TBE,電泳溫度14℃,電泳參數(shù)低分子量設(shè)為30kb,高分子量設(shè)為700kb,電泳時間20h,脈沖時間2.16～63.8s,電壓6V,轉(zhuǎn)換角度120℃。1.4.4從圖片上獲取染料和照片電泳結(jié)束后取出膠塊,放在1μg/mlEB溶液托盤內(nèi),染膠30min。用純水脫色。用BVO-PRLNT凝膠成像系統(tǒng)拍攝圖像。1.4.5分類方法將香港海鷗菌脈沖場電泳圖譜用BioNumerics5.1軟件導(dǎo)入,根據(jù)條帶的差異,用UPGMA算法進行聚類分析。2結(jié)果2.1革蘭氏陰性桿菌7株菌株在頭孢哌酮血平皿上為無色半透明灰白色菌落,光滑、圓整、濕潤,大小約1～2mm,不溶血,涂片染色鏡檢為革蘭氏陰性無芽胞桿菌,形狀呈海鷗狀或S狀。7株分離株經(jīng)API20NE生化鑒定結(jié)果均為香港海鷗菌,其來源與分布見表1。2.27株香港海鷗菌的形態(tài)分析7株香港海鷗菌經(jīng)NotⅠ原位酶切,經(jīng)20h電泳后,在20～1100kb范圍產(chǎn)生了11～14條帶的圖譜。各菌株間DNA圖譜其條帶位置和數(shù)量完全一致定為同一型別,有1條及1條以上條帶不一致,即判為不同型別,據(jù)此,7株香港海鷗菌可分為6個分子型。結(jié)果見圖1。2.3基于upgm算法的聚類分析將7株香港海鷗菌脈沖場凝膠電泳圖譜用BioNumerics5.1軟件導(dǎo)入,根據(jù)條帶的差異,用UPGMA算法進行聚類分析,得到同源圖譜樹狀圖,見圖2。gx2005086與gx2005212菌株相似度高達100%,其他菌株相似度均低于70%,最低僅30%,提示其余5株菌在PFGE分型存在較大的遺傳差異。3香港海鷗菌分子分型同源生物體是同種的不同個體,具有相同的毒力因子、生化特征和基因特性。通常大暴發(fā)或大流行所分離到的病原體大都具有相同的遺傳結(jié)構(gòu)或相近基因構(gòu)成。因此,在疾病監(jiān)測與預(yù)警中,病原的分子分型對于食物中毒暴發(fā)、水污染暴發(fā)、醫(yī)院內(nèi)感染暴發(fā)等公共衛(wèi)生事件傳染源或污染源的識別與追蹤,事件的預(yù)防與控制非常重要。PFGE技術(shù)因其具有能夠?qū)φ麄€染色體進行分析,穩(wěn)定性和重復(fù)性好,區(qū)分能力強,易于標準化,可通過網(wǎng)絡(luò)建立共享數(shù)據(jù)庫便于實驗室比較等優(yōu)點,已成為細菌及真菌分子學(xué)研究的重要手段。本研究應(yīng)用PFGE技術(shù)對新發(fā)現(xiàn)的食源性病原香港海鷗菌進行分子分型,可將7株香港海鷗菌分為6個PFGE型別。在20～1100kb范圍產(chǎn)生了11～14條帶的圖譜,各條帶清晰可辨,表明PFGE應(yīng)用于香港海鷗菌分子分型技術(shù)上可行,同時也表明,除了2株香港海鷗菌遺傳相似度高度同源外,其余的菌株間遺傳差異比較大。本研究發(fā)現(xiàn),2株分離于相距數(shù)百公里不同地點的香港海鷗菌相似性達100%,而從樣品采集調(diào)查資料分析,2份水產(chǎn)品樣品從養(yǎng)殖、運輸與出售過程均沒有交集。有研究表明,水鳥極有可能是香港海鷗菌的重要傳播媒介,丁華等香港海鷗菌作為一種新發(fā)現(xiàn)的食源性病原菌,其在淡水魚中的污染及病人中的感染已得到證實,但是對其毒力基因、傳播途徑、傳播