草地種子愈傷組織誘導(dǎo)及檸檬酸抑制研究

草地種子愈傷組織誘導(dǎo)及檸檬酸抑制研究

草地早熟草是我國南北地區(qū)廣泛應(yīng)用的冷季草，適應(yīng)性強(qiáng)，夏季適應(yīng)性強(qiáng)。它具有良好的耐踐踏性和很長的綠化時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)，并具有良好的坪面效應(yīng)。經(jīng)常用作草坪的重要草種，如公共綠地、家庭庭院、道路障礙、操場、網(wǎng)球場等。同時(shí)，它也存在著易受刺激的缺點(diǎn)，抗旱性差，溫度敏感等。外植體褐變是在植物組織培養(yǎng)過程中影響組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因素本研究對(duì)生產(chǎn)上常用的3個(gè)草地早熟禾品種愈傷組織誘導(dǎo)率和出愈時(shí)間進(jìn)行系統(tǒng)研究,試驗(yàn)以草地早熟禾成熟種子為外植體,研究浸泡、研磨和接種方式等因素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響,以期為優(yōu)化組織培養(yǎng)體系奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)以繼代培養(yǎng)中愈傷組織的褐化控制為目的,通過在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加不同濃度的檸檬酸,以優(yōu)化選擇能夠有效控制愈傷組織褐化的檸檬酸濃度,從而較好地解決多年生黑麥草愈傷組織繼代培養(yǎng)中的褐化問題。1材料和方法1.1供試品種和材料試驗(yàn)于2013年在中國林業(yè)科學(xué)研究院國家重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,供試材料為草地早熟禾新歌萊德、午夜、納蘇品種成熟種子,購自北京綠冠草業(yè)股份有限公司。1.2植物激素的測定試驗(yàn)主要試劑如下:吐溫-20(Tween-20)、蔗糖、瓊脂粉、次氯酸鈉溶液(活性氯﹥5%)為北京化工廠生產(chǎn);2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-dichlorophenoxyaceticacid)、6-芐氨基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine)等植物激素均購自北京化學(xué)試劑公司。愈傷組織誘導(dǎo)及再生培養(yǎng)基配方愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS愈傷組織分化培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基添加0.1mg·L生根培養(yǎng)基:1/2MS添加蔗糖20g·L1.3次氯酸鈉水溶液、吐溫、沖洗液的制備稱取適量成熟種子于50mL離心管中,加入25mL次氯酸鈉溶液、15mL蒸餾水和1~2滴吐溫-20,在磁力攪拌器(S21-3型,上海予騰生物科技有限公司)上消毒1h,以無菌水沖洗3~5次1.4消毒處理1.4.1浸泡處理消毒處理的草地早熟禾成熟種子加入20mL無菌水,將種子置于4℃黑暗條件下分別浸泡處理48h和72h,每種處理3個(gè)重復(fù),接種樣本量為60粒/皿。在操凈工作臺(tái)內(nèi)以無菌水沖洗2次,再次以25mL次氯酸鈉溶液添加15mL無菌蒸餾水消毒20min,無菌水沖洗5~6次后,用無菌濾紙吸干多余水分備用。1.4.2研磨處理接種前,分別將經(jīng)過浸泡處理的種子在無菌研缽中研磨損傷1min(簡稱研磨)或不研磨,研磨程度以磨破種皮為宜,每處理3個(gè)重復(fù),接種樣本量為60粒/皿。1.4.3接種方式本研究根據(jù)種子在培養(yǎng)基上的放置方式不同,經(jīng)過研磨和未研磨的種子分別以隨機(jī)接種和機(jī)械接種方式接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。機(jī)械接種:將種子種臍朝下,按粒排列接種于培養(yǎng)基上,每皿種子數(shù)為60粒。隨機(jī)接種:將一定數(shù)目的種子隨機(jī)放置于培養(yǎng)基上,使種子呈自然分散狀態(tài)1.5培養(yǎng)基的更換將消毒后經(jīng)過不同處理的種子分別接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,25℃黑暗培養(yǎng)。每2周更換1次新的培養(yǎng)基。成熟種子在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)若干天后,大部分種子開始長芽和根,待芽基部出現(xiàn)白色的愈傷組織小塊后,應(yīng)及時(shí)剪去芽和根,以免培養(yǎng)基養(yǎng)分流失過快,促進(jìn)愈傷組織小塊的生長1.6防褐劑的添加量胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)若干次后,逐漸出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。為了緩解愈傷組織褐化現(xiàn)象,需要在培養(yǎng)基中添加防褐劑。試驗(yàn)選取的防褐劑為檸檬酸(Citricacid),設(shè)置5個(gè)濃度,每個(gè)濃度的添加量見表2。將不添加任何防褐劑的對(duì)照組設(shè)置其濃度為0,共6組。分別記錄檸檬酸處理7、14d后的褐化率以及在培養(yǎng)基中添加檸檬酸對(duì)愈傷組織生長的影響。1.7受傷組織的分裂和再生挑選生長良好,緊密,黃色顆粒狀胚性愈傷組織1.8愈傷組織褐化率0.對(duì)草地早熟禾種子愈傷組織誘導(dǎo)率、褐化率、分化率、生根率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。愈傷組織誘導(dǎo)率=(出愈數(shù)/接種外植體數(shù))×100%;愈傷組織褐化率=(愈傷組織褐化個(gè)數(shù)/總愈傷組織數(shù))×100%(愈傷組織出現(xiàn)褐化現(xiàn)象即計(jì)入褐化個(gè)數(shù));愈傷組織分化率=(有芽形成的愈傷組織數(shù)/接種的愈傷組織總數(shù))×100%;生根率=(有根形成的不定芽/接種的不定芽總數(shù))×100%。所得數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,采用Duncan法對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率進(jìn)行多重比較。2結(jié)果與分析2.1不同處理對(duì)愈傷組織生長和誘導(dǎo)率的影響經(jīng)過處理的外植體接種后誘導(dǎo)培養(yǎng)7~10d后,部分種子基部出現(xiàn)胚芽。接種14d后,多數(shù)種子出芽,出芽后的種子大部分開始出愈(圖1)。此時(shí)分別拔掉和剪斷新長出來的芽和根,以免培養(yǎng)基養(yǎng)份流失過快。接種21d,將已經(jīng)誘導(dǎo)出非胚性愈傷組織的種子進(jìn)行第1次繼代,培養(yǎng)于新的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(圖2-A);剩余未出愈的種子繼續(xù)培養(yǎng)觀察,避免污染。接種28d,即非胚性愈傷組織第1次繼代培養(yǎng)7d后,非胚性愈傷組織中出現(xiàn)少數(shù)胚性愈傷組織(圖2-B),接種35d后進(jìn)行第2次繼代于新的培養(yǎng)基上,觀察其愈傷組織生長增殖情況。第2次繼代培養(yǎng)的胚性愈傷組織在新的培養(yǎng)基上生長3周后,同一克隆的胚性愈傷組織生長增殖1倍~2倍(圖2-C),每3周換新的培養(yǎng)基繼代1次。分別在接種培養(yǎng)5、7、14、21、28d后對(duì)3個(gè)品種統(tǒng)計(jì)其愈傷組織誘導(dǎo)率,由表3可知,種子愈傷組織誘導(dǎo)率隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間逐漸增加。誘導(dǎo)培養(yǎng)7、14、21、28d后,48h浸泡處理和72h浸泡處理所得到的的3個(gè)品種成熟種子的愈傷組織誘導(dǎo)率出現(xiàn)極顯著差異,新歌來得、午夜、納蘇種子在48h浸泡處理下所得到的愈傷組織誘導(dǎo)率最高分別可達(dá)100%、85%、95.01%,而在72h浸泡處理下得到的愈傷組織誘導(dǎo)率最高分別為85.71%、66.67%、87.5%。結(jié)果表明,浸泡48h處理更有利于種子愈傷組織誘導(dǎo),而隨著浸泡時(shí)間延長愈傷組織平均誘導(dǎo)率逐漸下降,且3個(gè)品種的出愈時(shí)間均往后推遲。根據(jù)以上所得到的結(jié)果,后面的研究均在種子浸泡48h處理?xiàng)l件下進(jìn)行。由表3及圖3可知,在種子浸泡48h條件下,愈傷組織誘導(dǎo)率分別在培養(yǎng)5、7、14、21、28d后,研磨處理與未研磨處理所得到的3個(gè)品種種子愈傷組織誘導(dǎo)率無明顯差異。因此,研磨處理或無研磨處理對(duì)草地早熟禾3個(gè)品種愈傷組織誘導(dǎo)率無明顯影響。由表3及圖4可知,接種方式對(duì)種子愈傷組織誘導(dǎo)率的影響十分重要。結(jié)果分析表明,在種子浸泡48h,未經(jīng)研磨處理?xiàng)l件下,種子愈傷組織誘導(dǎo)率分別在培養(yǎng)7、14、21、28d后,分別采用隨機(jī)接種與機(jī)械接種方式所得到的種子愈傷組織誘導(dǎo)率差異極顯著,結(jié)果表明,隨機(jī)接種方式更有利于種子愈傷組織誘導(dǎo)。根據(jù)以上結(jié)果可以總結(jié),種子浸泡48h條件下,無需經(jīng)過研磨處理,以隨機(jī)接種方式接種,更有利于多年生黑麥草3個(gè)品種愈傷組織誘導(dǎo)。2.2檸檬酸對(duì)胚性愈傷組織的生長的影響外植體接種后在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)培養(yǎng)28d左右,胚性愈傷組織形成,在新的培養(yǎng)基上每生長3周更換新的培養(yǎng)基繼代1次。在胚性愈傷組織形成后第3~5次繼代培養(yǎng)過程中,少數(shù)逐漸開始出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。選擇繼代3次生長良好的胚性愈傷組織,分為6組,在培養(yǎng)基中添加不同濃度的檸檬酸分別培養(yǎng)1周和2周。褐化個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表4所示,不同濃度的檸檬酸對(duì)愈傷組織褐化現(xiàn)象的抑制程度不同,結(jié)果表明在愈傷組織的繼代培養(yǎng)中對(duì)愈傷組織褐化抑制效果最好的濃度是2mg·L2.3受傷組織的分化和生根培養(yǎng)經(jīng)試驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)2mg·L3不同接種方式對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響組織培養(yǎng)中外植體的選擇是快速建立再生體系的關(guān)鍵因素之一。草地早熟禾可以用胚根、胚軸、幼穗、匍匐莖、莖尖、分生組織、花粉、種子為外植體,其中幼穗的胚性愈傷組織率在報(bào)道中最高,但其取材受季節(jié)限制。因取材方便,本試驗(yàn)采用成熟種子為外植體。本研究中未經(jīng)處理的新歌萊德、午夜、納蘇成熟種子在正常生長狀態(tài)下的平均發(fā)芽率在培養(yǎng)6d后達(dá)到最高,分別為72%、84%、70%,而用水低溫浸泡處理方法可以快速有效地促進(jìn)種子發(fā)芽,這在很多研究報(bào)道中都已被證實(shí)。如谷安琳等試驗(yàn)過程中研磨處理時(shí)應(yīng)以種子種皮磨損為宜,研磨程度過重會(huì)導(dǎo)致種子內(nèi)部受損而破壞種子生活力,而研磨程度過輕,種皮層并沒有受到破壞,種子發(fā)芽率和出愈率也不能得到提高。但是試驗(yàn)中研磨后的種子愈傷組織誘導(dǎo)率與未研磨處理沒有明顯差異,這可能是由于草地早熟禾種子自身種皮薄等生理特性的原因。在浸泡48h處理下,無論采取機(jī)械接種或隨機(jī)接種方式接種,研磨處理與未研磨處理所得到的3個(gè)品種種子愈傷組織誘導(dǎo)率均無明顯差異;而在種子浸泡48h,未經(jīng)研磨處理?xiàng)l件下,分別采用隨機(jī)接種與機(jī)械接種方式所得到的3個(gè)品種種子愈傷組織誘導(dǎo)率差異極顯著,這表明接種方式對(duì)草地早熟禾成熟種子愈傷組織誘導(dǎo)有很大的影響,而這方面的研究報(bào)道極少,也是本研究的新穎之處。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)繼代時(shí)間過短或過長都不利于成熟種子愈傷組織的分化。隨著繼代培養(yǎng)時(shí)間的延長,愈傷組織的顏色逐漸變黃,且結(jié)構(gòu)致密,干燥易碎。但是后期愈傷組織出現(xiàn)不同程度的褐變現(xiàn)象,而愈傷組織的分化率也隨著繼代時(shí)間的增加先呈上升趨勢,然后再大幅度的下降。這說明愈傷組織繼代時(shí)間的長短對(duì)愈傷組織的再生有著重要的影響,繼代天數(shù)過長不利于愈傷組織的生長,這與楊茹等試驗(yàn)結(jié)果表明以檸檬酸作為防褐劑添加在愈傷組織生長培養(yǎng)基中,可以有效的抑制外植體的褐化現(xiàn)象。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn),檸檬酸處理后,愈傷組織褐化率降低的同時(shí),其生長增殖情況未見明顯影響,因此選擇添加適當(dāng)濃度的檸檬酸抑制草地早熟禾愈傷組織褐化現(xiàn)象是一種可行的方法。王穎等4不同濃度檸檬酸對(duì)繼代培養(yǎng)愈