白腐菌采絨革蓋菌coriolusversicol漆酶催化木素的聚合

白腐菌采絨革蓋菌coriolusversicol漆酶催化木素的聚合

隨著木素分解酶促進(jìn)木素的應(yīng)用，闡明了該酶也可以通過促進(jìn)酚類化合物的聚合而產(chǎn)生。一些木腐菌胞外分泌的真菌漆酶(benzenediol:oxygenoxidoreductase,EC1.10.3.2)一直被認(rèn)為可以作為生物處理應(yīng)用于造紙工業(yè)中。XavierFont等使用采絨栓菌(Trametesversicolor)處理造紙廢水,除去其中的顏色、芳香族化合物以及COD含量。結(jié)果表明漆酶的產(chǎn)量與毒性的減少呈線性關(guān)系。耿興蓮等在處理木質(zhì)素磺酸鹽廢液時(shí),處理12h后,木質(zhì)素磺酸鹽分子量分布明顯向高分子量方向移動(dòng)。趙芳等研究了木素前驅(qū)物松柏醇-葡萄糖苷與造紙廢水中木素碳水化合物的酶催化聚合作用。結(jié)果表明木素碳水化合物分子量增長明顯。王松等研究了松柏醇漆酶催化處理廢水。數(shù)據(jù)顯示:在漆酶存在的條件下,松柏醇可以有效地聚合廢水中水溶性木素。然而,在大多數(shù)先前的的研究中,商業(yè)的粗漆酶其中有其它酚類氧化酶的污染物。這些實(shí)驗(yàn)不能證明純漆酶對廢水中木質(zhì)素的聚合反應(yīng)的效果。本研究利用采絨革蓋菌C.versicolor經(jīng)發(fā)酵純化得到純漆酶,通過添加漆酶于二沉池廢水中,考察了漆酶對木素的催化聚合,利用紫外分光光度計(jì)測定了廢水中的木質(zhì)素含量。通過GPC分析了從廢水中分離木質(zhì)素的分子量,證實(shí)漆酶對木質(zhì)素催化聚合的作用。在漆酶的催化作用下,廢水中的可溶性木素及其衍生物發(fā)生聚合反應(yīng),從而通過絮凝沉淀除去,達(dá)到降低COD和色度的目的,進(jìn)而達(dá)到對造紙廢水深度處理的標(biāo)準(zhǔn)。1流動(dòng)相及色譜相的選擇1.1原料和試劑原料:漆酶由采絨革蓋菌C.versicolor發(fā)酵純化制取。水樣取自山東某造紙廠堿法木漿制漿造紙綜合廢水經(jīng)生化處理后的二沉池出水,木素從二沉池出水中提取。試劑:ABTS購自Sigma公司,重蒸水,標(biāo)樣:ShodexStandardSL-105(SHIMADZUCORPORATION)1.2色譜分析條件Shim-packGPC-803D(300mm*8mm);流動(dòng)相為二甲基甲酰胺(DMF);流動(dòng)相流速:0.5mL/min;柱溫35℃;進(jìn)樣量15uL;標(biāo)樣為己知分子量的聚苯乙烯標(biāo)樣(31400;10700;4730;2900);檢測器為示差檢測器。1.3流動(dòng)相的選擇流動(dòng)相的選用原則首先是能夠?qū)悠啡芙?或樣品用另一少量溶劑溶解再用流動(dòng)相分散呈均勻溶液,且流動(dòng)相不與填料發(fā)生作用,而且應(yīng)與檢測器相匹配,溶劑粘度要小,毒性小,價(jià)格便宜等因素,最后選用二甲基甲酰胺(DMF)作為流動(dòng)相。1.4廢水中木素的提取方法二沉池廢水中提取木素的流程見圖1。1.5木素試樣的乙?；?.6木素的催化聚合試驗(yàn)取500mL水樣兩份于兩個(gè)錐形瓶中,加入等量的純漆酶液和微量的介體ABTS,在55℃水浴條件中曝氣反應(yīng)。分別在1h和2h停止反應(yīng),靜止沉淀2h,倒掉上清液,將沉淀進(jìn)行真空干燥。此沉淀即為經(jīng)漆酶催化聚合后的木素。1.7木素分子量和含量的測定1.7.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制將一系列己知分子量的標(biāo)樣聚苯乙烯分別用流動(dòng)相溶解制成每1mL中約含10mg的溶液,分別注入15μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液,記錄示差色譜圖,以保留體積(或保留時(shí)間)對分子量的對數(shù)作圖,在一定分子量范圍內(nèi)得到一直線(標(biāo)準(zhǔn)曲線),然后將待測物用流動(dòng)相溶解制成每1mL中約含10mg的溶液進(jìn)行分析,記錄示差色譜圖。最后根據(jù)待測定物在同一條件下的保留體積(或保留時(shí)間),從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得/計(jì)算出其分子量。1.7.2測定項(xiàng)目及方法由于木素的紫外吸收光譜在280nm處有特征吸收峰,因此,可以在波長280nm下定量地測定木素的含量(濃度)。木素濃度與吸光度的線性關(guān)系如圖2所示。計(jì)算公式如下:式中A-吸光度;a-吸收系數(shù),此水樣吸收系數(shù)采用26.1;b-比色皿的厚度1cm;c-測定液中木素吸收濃度(g/L)。2結(jié)果與討論2.1從沉淀池中提取木素取2L二沉池出水,按照1.4節(jié)中圖1的方法將廢水中的木素提取出來,在真空干燥箱里烘干,稱重,得到178mg絕干木素。2.2反應(yīng)時(shí)間對殘余木素含量的影響分別取6份100mL二沉池出水于250mL的錐形瓶中,加入等量純漆酶140IU和適量的ABTS,在55℃水浴條件下曝氣反應(yīng),分別在反應(yīng)1h、2h、3h、4h、5h、6h時(shí)停止曝氣,將上清液取出分別測定上清液中的木素含量,將得到的沉淀物在真空干燥箱里烘干、稱重。從表1可以看出隨著反應(yīng)時(shí)間的增加,殘余木素含量逐漸降低,但是降低的速率逐漸減小,隨著反應(yīng)時(shí)間的增加,沉淀物干重逐漸增加,但是沉淀物干重逐漸增加的速率逐漸減小。鑒于此種實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象,以及前人的相關(guān)研究,推測原因?yàn)?在有氧的條件下,漆酶將二沉池出水中的殘余木素及其衍生物催化聚合,產(chǎn)生的沉淀物即為木素及其衍生物的聚合物,下面我們將驗(yàn)證漆酶對木素的聚合作用。2.3木素的分子量按照1.7.1節(jié)的方法,經(jīng)計(jì)算得原廢水中木素的分子量為3.12萬,經(jīng)純漆酶液處理1h后的木素的分子量為4.66萬,經(jīng)純漆酶液處理2h后的木素分子量為5.86萬。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明經(jīng)過漆酶處理后,廢水中木素的分子量明顯變大。漆酶處理前后木素的分子量分布譜圖如圖3,圖4,圖5所示,測定的分子量數(shù)據(jù)見表2。2.4多分散系數(shù)的計(jì)算分子質(zhì)量是聚合物試樣最基本的指標(biāo)之一,可以通過數(shù)均和重均分子質(zhì)量來了解其平均分子質(zhì)量的大小和變化。但是,木素分子是不均一的高聚物,分析其不均一性,即多分散性對于了解整個(gè)木素分子質(zhì)量的變化有著重要的意義通常用多分散系數(shù)來表示木素多分散性,多分散系數(shù)有多種計(jì)算方法,這里選擇常用的一種,即重均和數(shù)均分子質(zhì)量的比值(MW/MN)。造紙廠二沉池出水中殘余木素和經(jīng)酶催化聚合后木素的多分散系數(shù)都變化不大,其比較見表3。由表3可以看出,造紙廠二沉池出水中殘余木素和經(jīng)酶催化聚合后木素的多分散性都較小,說明該三種木素中含有的木素分子大小均一性較好,木素分子量趨于一致,使得多分散性降低。3木素的組成及構(gòu)成(1)造紙廠二沉池出水中木素的分子量為3.12萬,經(jīng)純漆酶液處理1h后的木素的分子量為4.66萬,經(jīng)純漆酶液處理2h后的木素分子量為5.86萬。此三種木素的多分散性較低,說明含有的木素分子大小均一性較好,木素分子量趨于一致。(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明:經(jīng)過漆酶處理后,廢水中木素的分子量明顯變大,此種實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象說明,漆酶在反應(yīng)中對木素起到