第四章 DNA重組和基因轉(zhuǎn)移

第四章DNA重組和基因轉(zhuǎn)移第一節(jié)目的基因與載體的連接一粘末端DNA片段的連接（一）具有相同粘末端的DNA分子之間的連接

使用堿性磷酸酶處理載體DNA，去掉其5’末端的磷酸基，以防質(zhì)粒DNA的自身環(huán)化。（二）具有不同粘性末端的DNA分子之間的連接

用兩種不同的限制性內(nèi)切酶對(duì)載體和外源DNA進(jìn)行切割后，在它們兩端會(huì)產(chǎn)生非互補(bǔ)的突出端，經(jīng)DNA連接酶連接后即產(chǎn)生定向重組體。

HindIIIEcoRIHindIIIEcoRI對(duì)載體酶切HindIIIEcoRI對(duì)基因酶切質(zhì)粒載體的定向重組二平末端DNA片段的連接1直接用T4連接酶連接2同聚物加尾法3銜接物連接法銜接物是指用化學(xué)方法合成的一段由10～12個(gè)核苷酸組成，具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的平末端的雙鏈寡核苷酸片段。所謂載體與DNA片段酶切位點(diǎn)不匹配，指載體與待克隆的DNA片段上的酶切位點(diǎn)不相同，因而用一種或兩種酶切制造不出可互補(bǔ)的粘性末端。

1按照平末端連接方法加上接頭2將凹端變?yōu)槠蕉耍?）使用Klenow酶在4種dNTP存在下，將3′凹端完全補(bǔ)平。（2）用S1核酸酶去除3′突出末端產(chǎn)生平端DNA分子

三載體與DNA片段酶切位點(diǎn)不匹配的連接3使用大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段部分補(bǔ)平3′凹端轉(zhuǎn)變成粘端。載體經(jīng)XhoI酶切形成：外源基因用San3A酶切形成：用Klenow酶部分補(bǔ)平二者的3′凹端，形成：TCGAAGCTGATCCTAGCTTCAGGA這樣，就可以實(shí)現(xiàn)有效重組。TCGAAGCT3′3′5′5′GATCCTAG3′3′5′5′四cDNA與載體的連接通過依次加入、連接合成的DNA接頭進(jìn)行cDNA克隆第二節(jié)重組DNA分子的篩選與鑒定外源基因與載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌可能的三種情況：（2）（3）（1）轉(zhuǎn)化E.coli一遺傳檢測(cè)法（一）根據(jù)載體表型特征選擇重組體分子1抗藥性標(biāo)記插入失活篩選法例：pBR322如果外源基因插入到tetr基因內(nèi)部，tetr抗性消失，表型為不抗四環(huán)素（tets）、而仍抗氨芐青霉素（ampr），這樣的轉(zhuǎn)化細(xì)胞在含有

amp的培養(yǎng)基仍可生長(zhǎng)，但在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上不能再生長(zhǎng)；反之，如果ampr基因由于外源基因插入其內(nèi)部而失活，帶有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞在含有tet的培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)，在含有

amp的培養(yǎng)基不能生長(zhǎng)。

例:pUC質(zhì)粒在LacZ—的大腸桿菌中，在平板培養(yǎng)中，菌落是白色的。若在該細(xì)胞中引入pUC質(zhì)粒，其上有LacZ′，質(zhì)粒和大腸桿菌DNA可實(shí)現(xiàn)α—互補(bǔ)，菌落呈藍(lán)色。如果在質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)的某個(gè)酶切點(diǎn)上克隆了外源基因，則LacZ′基因受到破壞，便不能再和缺陷型受體菌中生成有活性的β-半乳糖苷酶，因此，菌落呈白色。

（二）根據(jù)插入序列的表型特征選擇重組體

進(jìn)入受體細(xì)胞的重組DNA分子中的外源基因如果在宿主細(xì)胞中能實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出有功能活性的基因產(chǎn)物，那么鑒定此種重組體最簡(jiǎn)便的方法就是表型特征的直接選擇法。

2α—互補(bǔ)二物理檢測(cè)法凝膠電泳檢測(cè)法三核酸雜交檢測(cè)法

例：原位雜交篩選重組體菌落(或噬菌斑)四免疫化學(xué)檢測(cè)法

免疫化學(xué)檢測(cè)法是利用抗體與抗原結(jié)合的高度特異性來鑒別基因的。如果某個(gè)重組克隆中的外源基因能夠表達(dá)，在這個(gè)克隆中就存在著這個(gè)基因的特定蛋白，即可用特異性抗體來檢測(cè)。常用的有標(biāo)記抗體測(cè)定法和免疫沉淀測(cè)定法兩種。標(biāo)記抗體測(cè)定法的步驟：轉(zhuǎn)化菌落影印平板置于含氯仿飽合氣體的容器細(xì)菌裂解，抗原釋放覆蓋吸附有未經(jīng)標(biāo)記的抗體的NC膜形成抗原抗體復(fù)合物將NC膜與I125標(biāo)記的抗體溫育

放射自顯影與母板對(duì)照，挑取所需的重組克隆

用免疫化學(xué)法檢測(cè)克隆在表達(dá)載體pUC8上的基因第三節(jié)基因轉(zhuǎn)移方法一重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌

（一）轉(zhuǎn)化

將外源DNA分子導(dǎo)入某一宿主細(xì)菌細(xì)胞的過程都叫轉(zhuǎn)化。

為了有效地使細(xì)菌吸收外源的DNA分子，我們通常要對(duì)它們進(jìn)行一些物理或化學(xué)的處理，處理后的細(xì)胞吸收外源DNA的能力大大提高，被稱為感受態(tài)細(xì)胞。對(duì)于大腸桿菌細(xì)胞，一般采用50mmol/L的CaCl2溶液來制備感受態(tài)細(xì)胞。（1）吸附階段：完整的雙鏈DNA分子吸附于感受態(tài)細(xì)胞表面（2）轉(zhuǎn)入階段：雙鏈DNA分子解鏈，以單鏈形式進(jìn)入細(xì)胞，而另一鏈則被降解

（3）自身穩(wěn)定階段：外源質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)又復(fù)制成雙鏈環(huán)型DNA（4）表達(dá)階段：即目的基因隨質(zhì)粒的復(fù)制子一起復(fù)制