星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化美斯地濃聚乳酸納米粒處方

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化美斯地濃聚乳酸納米粒處方

美斯茨坦是一種可逆的膽堿酯酶抑制劑，與非去極化神經(jīng)肌肉阻滯劑反應(yīng)一致。它用于治療50年前的嚴(yán)重肌力障礙。它還可以用于手術(shù)后的腹部腫脹和尿潴留。MT極易溶于水,半衰期為1~2h,在健康志愿者體內(nèi)的生物利用度僅為11.5~18.9%,對于成年患者口服其片劑的常規(guī)劑量為每天5~6次。本實(shí)驗(yàn)將聚乳酸納米緩釋系統(tǒng)應(yīng)用于半衰期短、生物利用度低的化學(xué)藥物MT,以延緩藥物的釋放,延長半衰期,從而減少給藥次數(shù),提高患者的順應(yīng)性,提高藥物療效,提高口服生物利用度。本實(shí)驗(yàn)對美斯地濃聚乳酸納米粒[mestinonpoly(lacticacid)nanoparticles,MTPNP]的制備工藝進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究,首先確定反應(yīng)條件評價(jià)指標(biāo),在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以星點(diǎn)設(shè)計(jì)(centralcompositedesign,CCD)與效應(yīng)面法(responsesurfacemethodology,RSM)結(jié)合的方法進(jìn)一步優(yōu)化MTPNP的制備工藝。星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法具有試驗(yàn)精度高,模型預(yù)測性好的特點(diǎn),在藥學(xué)應(yīng)用中成效顯著。1儀器、材料和仿生材料DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);分析電子天秤(瑞士MettlerToledo儀器公司)。MT(武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司,批號:20080302,純度>99%);聚乳酸(PLA,Mw為5.910×104Da,重慶大學(xué)生物工程學(xué)院生物材料與仿生工程中心提供);聚乙烯醇(PVA-217,日本可樂麗公司);二氯甲烷[分析純,重慶川東化工(集團(tuán))有限公司]。2方法和結(jié)果2.1mtpnp含量測定方法根據(jù)MT極溶于水的性質(zhì),將其溶于水作為內(nèi)水相(W1),將聚乳酸溶于二氯甲烷中作為油相(O),兩相混合高速攪拌乳化形成穩(wěn)定的W1/O初乳,將初乳快速滴加到含有乳化劑PVA的水溶液(W2)中,繼續(xù)攪拌制成W1/O/W2復(fù)乳,室溫下減壓旋蒸除去有機(jī)溶劑,得到藥物納米粒的混懸液,12000r·min-1離心10min,分離納米粒和游離藥物,測定游離藥物的含量,從而計(jì)算出MTPNP的包封率和載藥率。由于采用直接分光光度法測定藥物含量,空白輔料在藥物最大吸收波長269nm處也有吸收,干擾測定,而二階導(dǎo)數(shù)光譜法則可以消除空白輔料的干擾,因此選用二階導(dǎo)數(shù)光譜法測定MTPNP混懸液中游離藥物的含量,得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為D=0.0094C+0.0066,r=0.9998,MT在16.68~38.92mg·mL-1內(nèi)與振幅值(D)呈良好的線性關(guān)系。MTPNP在低、中、高濃度的加樣回收率分別為100.05%,99.56%及101.32%,其RSD分別為0.76%,0.25%,0.21%,該方法回收率良好,滿足含量測定要求。計(jì)算公式:包封率/%=(Wt-Wf)/Wt×100%;載藥量/%=(Wt-Wf)/Ws×100%。式中:Wt為MT初始投入量,Wf為MT游離藥物的質(zhì)量,Ws為納米粒的總質(zhì)量。2.2星點(diǎn)設(shè)計(jì)與應(yīng)用表面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法2.2.1最佳制備條件的確定據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,在單因素考察基礎(chǔ)上,利用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對3個(gè)影響顯著的因素做進(jìn)一步的優(yōu)化。以MT投藥量(X1,mg)、PLA濃度(X2,%)、PVA濃度(X3,%)為因素,每個(gè)因素設(shè)置5個(gè)水平,分別用代碼值-1.68,-1,0,1,1.68表示,結(jié)果見表1,包封率和載藥量為效應(yīng)指標(biāo),用三因素,五水平的星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法用來優(yōu)化制備MT聚乳酸納米粒的最佳制備條件,優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。如表2所示,20組實(shí)驗(yàn)所制得的MTPNP包封率和載藥量的差異很大,其中包封率Y1的范圍為25.03%~49.66%,載藥量Y2的范圍為1.19%~6.91%。2.2.2包封率和載藥量根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以包封率和載藥量為評價(jià)指標(biāo)(因變量),應(yīng)用Designexperts7.1.6軟件,分別對各因素(自變量)進(jìn)行二項(xiàng)式擬合。其模型方程如下:其中,Yi為因變量,Y1和Y2分別代表包封率和載藥量。β0代表20組實(shí)驗(yàn)截距的平均值,βi分別代表Xi估計(jì)的系數(shù),主要影響因素X1,X2和X3代表改變?nèi)魏我粋€(gè)因素的范圍,即從最小值到最大值所產(chǎn)生影響的平均結(jié)果,相互作用的X1X2,X2X3和X1X3表示其中兩個(gè)因素同時(shí)改變對效應(yīng)值改變的影響,多項(xiàng)式X12,X22和X32是用來研究非線性的關(guān)系。以下為二項(xiàng)式方程:經(jīng)F檢驗(yàn)顯示以上方程的總模型方程均顯著(P<0.0001),且r值較高,因此,二項(xiàng)式擬合模型為最佳模型。對于包封率和載藥量的方差分析結(jié)果分別見表3和表4。2.2.3納米顆粒與載藥量的比較反應(yīng)變量因變量之間的關(guān)系可以從效應(yīng)面輕易直觀地觀察到,三維效應(yīng)面圖如圖1和圖2所示,高水平的X1X3,X2X3,X12,X32以及低水平的X3,X1X2所制備的納米粒包封率和載藥量都高,高水平的X2以及低水平的X1,X22是能夠制備得到較高包封率的適合條件,而高水平的X1,X22以及低水平的X2是制備得到較高載藥量的適合條件,以上分析表明,反應(yīng)變量與因變量(效應(yīng)變量)之間存在著復(fù)雜的關(guān)系。通過以上實(shí)驗(yàn)分析,得到的制備MTPNP的最佳處方為:MT投藥量為49.20mg,PLA濃度為3.31%,PVA濃度為3.41%。2.2.4最佳制備工藝條件驗(yàn)證的預(yù)測值為確定建立模型與實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否相符,通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)對模型可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。以制備MTPNP,共進(jìn)行6組實(shí)驗(yàn),取平均值與二項(xiàng)式方程在優(yōu)化的最佳制備工藝條件下模擬的預(yù)測值進(jìn)行比較,結(jié)果見表5。結(jié)果表明,制備的MTPNP的平均包封率和載藥量分別為(51.98±1.28)%和(7.01±0.31)%(n=3),而預(yù)測值分別為51.66%和6.94%,實(shí)測值與預(yù)測值相差低于2%,說明該模型預(yù)測性良好。證明實(shí)驗(yàn)所得到的擬合方程可以較好地描述因素與指標(biāo)的關(guān)系,星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化MTPNP制備工藝是可行的。2.3外釋放性能與粒徑研究2.3.1mtpnp釋放曲線采用動(dòng)態(tài)膜透析法考察最佳處方制備的MTPNP和原料藥MT的體外釋藥行為。取含MT10mg的MTPNP和MT原料藥,置于處理過的透析袋中,將含藥透析袋置于盛有150mLpH7.4磷酸緩沖溶液的錐形瓶中,每個(gè)樣品平行3份,溫度為(37±0.5)℃,轉(zhuǎn)速為100r·min-1,分別于0.17,0.5,1,2,4,6,8,12,24,48,72h定時(shí)取樣0.5mL,同時(shí)補(bǔ)加相同量的釋放介質(zhì),二階導(dǎo)數(shù)光譜法測定藥物含量,計(jì)算累積釋放百分率,并繪制釋放曲線,見圖3。由圖可知,MTPNP存在突釋現(xiàn)象,MTPNP中大約有50.05%的MT在0.5h之內(nèi)釋放出來,之后呈現(xiàn)緩慢釋放的趨勢,72h釋放量為57.03%;對于游離的MT藥物來說,在同樣條件下,0.5h內(nèi)釋放藥物量約為85.44%,24h釋放量為99.94%。與游離藥物相比,MTPNP的釋放速度相對緩慢,具有一定的緩釋效應(yīng)。2.3.2測定樣品為復(fù)合液MTPNP的粒徑和多分散性是在25℃條件下以激光粒度儀測定的,樣品在測定前用蒸餾水稀釋10倍,每個(gè)樣品測定3份,如圖4所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,按最佳處方制備的MTPNP平均粒徑為(722.9±4.3)nm,多分散系數(shù)(PDI)為0.095。3星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法MT是一種膽堿酯酶抑制藥,能夠抑制膽堿酯酶活性,但其半衰期短。本實(shí)驗(yàn)利用聚乳酸納米緩釋系統(tǒng)延緩其釋放,達(dá)到延長半衰期的目的,采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法確定了最佳處方,為制劑的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。在工藝優(yōu)化和處方篩選過程中,常需同時(shí)考察多個(gè)因素對結(jié)果的影響,并對結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化。采用單因素考察法能收到一定效果,但無法考察各因素間的相互作用。國內(nèi)常用均勻設(shè)計(jì)和正交設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化