不同培養(yǎng)基對(duì)小球藻生長與油脂累積的影響

不同培養(yǎng)基對(duì)小球藻生長與油脂累積的影響

作為一種新型生物柴油原料，微藻具有來源廣泛、成本低、清潔可再生等優(yōu)點(diǎn)。其中，以小型海藻為原料的生物肥油適合燃料發(fā)動(dòng)機(jī)燃燒，應(yīng)用前景非常明顯。微藻油脂組成與一般油料植物相似,以C16、C18系脂肪酸為主,脂類含量最高可達(dá)細(xì)胞干重的80%。影響微藻生長與油脂積累的因素很多,與藻種及培養(yǎng)條件密切相關(guān),其中培養(yǎng)基的影響最為顯著,并且不同藻種對(duì)營養(yǎng)元素的種類及濃度存在一定的偏好型。通常狀況下,如果培養(yǎng)基中的營養(yǎng)元素充足,微藻生長狀況良好,但油脂積累量相對(duì)較低;當(dāng)處于營養(yǎng)元素缺乏等環(huán)境壓力下時(shí),CO2則主要用于合成油脂以積蓄能量,油脂含量顯著上升,但細(xì)胞停止分裂,生物量下降,也不能滿足生物柴油制備的原料需求,所以探索最佳培養(yǎng)條件、利用生物技術(shù)獲取高油脂基因工程微藻已成為國際普遍關(guān)注的研究課題。本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)方法將實(shí)驗(yàn)室純化的Y-019及Y-041藻株鑒定為小球藻屬,并探討了它們與ChlorellavugarisFACHB-31在4種不同培養(yǎng)基條件下細(xì)胞生長和油脂積累情況,以此篩選出富油藻株,為進(jìn)一步提高其產(chǎn)油能力,以及規(guī)?；a(chǎn)提供基礎(chǔ)依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1藻類藻類1.1.2主試劑和設(shè)備1.2緩沖劑lds-eb法用改良Glassbeeds法提取微藻總DNA:取1.5mL處于對(duì)數(shù)生長期的微藻培養(yǎng)液,8000g離心1min收集沉淀。150μLddH2O冰上重懸細(xì)胞后加入350μLSDS-EB提取緩沖液(含5μL、20μg/μLRNase)和0.1g酸洗玻璃珠,室溫下充分渦旋15min。15000g離心5min后取上清,加入500μL酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提。15000g離心10min后取上清,加入500μL氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提。15000g離心10min后取上清,加入2倍體積無水乙醇于冰上沉淀30min。15000g離心10min后棄上清,加入70%乙醇洗滌沉淀2次。真空干燥后用40μLTE溶解沉淀,通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA分子質(zhì)量。1.31pcr擴(kuò)增及序列分析采用降落PCR方法擴(kuò)增1146bp的18SrDNA基因部分片段。PCR反應(yīng)體系(25μL)包括:DNA模板1μL,引物0.4μmol/L,TaqDNApolymerase0.5U,10×PCRBuffer2.5μL,2.5mmol/LdNTP2.0μL,ddH2O17.5μL。其中上游引物序列為5′-CAGCMGCCGCGGTAATWC-3′;下游引物序列為5′-ACGGGCGGTGTGTRC-3′。PCR反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性4min;95℃變性40s,68℃-58℃退火40s(每經(jīng)歷一個(gè)循環(huán)退火溫度降低1℃,當(dāng)退火溫度降為58℃時(shí)循環(huán)20次),72℃延伸20s,30個(gè)循環(huán);72℃10min;4℃∞。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳判斷目的片段大小。目的基因片段經(jīng)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收純化后,連接至pMD18-T質(zhì)粒載體上,轉(zhuǎn)化后篩選陽性菌落測序。向NucleotideBlast提交測序結(jié)果,搜索同源序列。1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作挑取固體平板上培養(yǎng)的各藻株至含有1mLddH2O的2mL離心管中,混合物用槍頭吹打均勻,分別取適量接種于含有50mLSE、BG11、HSM1、DS4種液體培養(yǎng)基的100mL三角燒瓶中,置于恒溫光照搖床中振蕩培養(yǎng)(培養(yǎng)條件為:25℃,230r/min,24h全光照,光照強(qiáng)度50~110μE/m2/s。SE培養(yǎng)基:NaNO30.25g/L,K2HPO4·3H2O0.075g/L,MgSO4·7H2O0.075g/L,CaCl2·2H2O0.025g/L,KH2PO40.175g/L,NaCl0.025g/L,Soilextract40mL,FeCl3·6H2O0.005g/L,Fe-EDTA1mL,A5solution1mL;BG11培養(yǎng)基:NaNO31.5g/L,K2HPO4·3H2O0.04g/L,MgSO4·7H2O0.075g/L,CaCl2·2H2O0.036g/L,citricacid0.006g/L,Ferricammoniumcitrate0.006g/L,EDTA(dinatrium-salt)0.001g/L,Na2CO30.02g/L,A5+Cosolution1mL;HSM1培養(yǎng)基:NH4Cl0.05g/L,K2HPO41.44g/L,KH2PO40.74g/L,MgSO4·7H2O0.02g/L,CaCl2·2H2O0.01g/L,Trace1mL;DS培養(yǎng)基:NaNO30.30g/L,CO(NH2)20.15g/L,K2HPO4·3H2O0.05g/L,FeC6H5O70.006g/L,CaCl2·2H2O0.025g/L,Soilextract10mL,Vb1200μg/L,Vb12400ng/L,Trace1mL)。培養(yǎng)至一定濃度后取樣,用滅菌雙蒸水進(jìn)行10倍濃度梯度稀釋,用酶標(biāo)儀測定490nm波長處各稀釋樣品的吸光值;同時(shí)取各稀釋樣品測定其干重,并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。培養(yǎng)期間每24h取樣一次,用酶標(biāo)儀測定490nm波長處的吸光值并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算其生物量,每組實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)平行。平均相對(duì)生長速率(R)用下式表示:R=(lnQ2-lnQ1)/(t2-t1)其中:Q1是第一次取樣時(shí)(t1)的生物量,Q2是第二次取樣時(shí)(t2)的生物量。1.5中性脂質(zhì)細(xì)度的檢測培養(yǎng)期間每24h取200μL藻液,在加入尼羅紅染料和孵育10min后,用熒光發(fā)光檢測儀以480nm為激發(fā)波長,575nm為消散波長分別測定光密度值A(chǔ)1和A2并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成油脂含量,二者之差即為中性脂的吸收值,每組實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)平行。同時(shí)取樣10μL藻液,與尼羅紅染料混合后制片,采用熒光顯微鏡,以480nm激發(fā)波長、570nm消散波長的熒光濾鏡觀察細(xì)胞中脂滴的大小、數(shù)量與方位。以Triolein做為油脂標(biāo)準(zhǔn)品在相同測定條件下檢測,并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。2結(jié)果與分析2.1srdna基因序列18SrDNA部分序列比對(duì)結(jié)果表明:Y-019、Y-041藻株都屬于綠藻門,綠藻綱,綠球藻目,小球藻科,小球藻屬。Y-019與Chlorellavulgaris(AB488582.1)等的18SrDNA基因的相似度為98%;Y-041與Chlorellapyrenoidosa(AB240151.1)的18SrDNA基因的相似度為99%。因此確定兩種分離藻株為ChlorellavulgarisY-019和ChlorellapyrenoidosaY-041。2.2小球藻的生長3株小球藻ChlorellavugarisFACHB-31、ChlorellavulgarisY-019和ChlorellapyrenoidosaY-041在4種培養(yǎng)基SE、BG11、HSM1和DS中培養(yǎng)12d的生長狀況如圖1所示。3株小球藻在SE培養(yǎng)基中生長速度較緩慢,接種12d后進(jìn)入生長平臺(tái)期(圖1-1),相對(duì)生長速率為0.39~0.49,生物量積累達(dá)0.73g/L(表1)。在BG11培養(yǎng)基中,3株小球藻的生長趨勢與在SE培養(yǎng)條件下類似(圖1-2),但生物量的積累平均為SE培養(yǎng)條件下的一半,生長平臺(tái)期生物量為0.29~0.34g/L(表1)。小球藻在DS培養(yǎng)基中培養(yǎng),生長速度較快,藻接種后培養(yǎng)8d進(jìn)入生長平臺(tái)期(圖1-4),相對(duì)生長速率在0.37~0.52之間,ChlorellapyrenoidosaY-041的的生長速率最高可達(dá)到0.52;但與其他培養(yǎng)基相比生物量較低。小球藻在HSM1培養(yǎng)基中生物積累量與SE培養(yǎng)基類似,但相比之下生長速度最快,并且藻種間生長差異較小,接種后5d細(xì)胞密度達(dá)到最大值(圖1-3),相對(duì)生長速率在1.19~1.57之間,是在SE、BG11、DS培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下的3倍(表1)。2.3生物柴油的積累3株小球藻ChlorellavugarisFACHB-31、ChlorellavulgarisY-019和ChlorellapyrenoidosaY-041在4種培養(yǎng)基SE、BG11、HSM1和DS中培養(yǎng)14d的油脂積累情況如圖2所示。3株小球藻在SE和BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下,培養(yǎng)至8d時(shí)油脂的積累量迅速提高,每克細(xì)胞干重的油脂積累量分別在0.14~0.18g和0.11~0.23g之間(圖2-1,圖2-2)。在HMS1培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下,ChlorellavulgarisY-019和其它兩種藻株ChlorellavugarisFACHB-31、ChlorellapyrenoidosaY-041呈現(xiàn)出較明顯的種間差異,培養(yǎng)至8d時(shí)相較其它2個(gè)藻株ChlorellavulgarisY-019油脂含量有明顯的提高(圖2-3)。在DS培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下,培養(yǎng)至8d時(shí)油脂的積累量迅速提高,10d后顯現(xiàn)明顯的種間差異,油脂的積累速度和積累量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在SE、BG11和HSM1培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件,其中藻種Y-019的油脂最大累量為每克干重0.55g/g,是在其它3株培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下的1.62~3.06倍(圖2-4)。DS培養(yǎng)基培養(yǎng)12d3株小球藻細(xì)胞中脂滴的積累狀態(tài)如圖3所示。黃色熒光代表以三酰甘油為主的中性脂,可通過轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)制備生物柴油;橘紅色熒光代表以磷脂為主的極性脂,主要參與膜的構(gòu)成和代謝調(diào)控。3株小球藻中ChlorellavulgarisY-019藻種細(xì)胞內(nèi)黃色熒光脂滴最多,ChlorellavugarisFACHB-311和ChlorellapyrenoidosaY-041狀態(tài)相似,與油脂含量定量分析結(jié)果相吻合。3小球藻油脂積累規(guī)律將微藻生長的最適條件與油脂累積的最佳條件綜合考慮,篩選出富含油脂的微藻藻株及其最佳的培養(yǎng)條件是實(shí)現(xiàn)微藻大規(guī)模培養(yǎng)的重要基礎(chǔ)。本文對(duì)比了3株小球藻ChlorellavugarisFACHB-31、ChlorellavulgarisY-019、ChlorellapyrenoidosaY-041在4種培養(yǎng)基SE、BG11、HMS1和DS中的生長情況及油脂的積累情況。不同培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下,3株小球藻生長狀態(tài)差異明顯,生物量和油脂含量的積累規(guī)律差異較大;在相同培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下生長情況種間差異較小,但是油脂積累情況有較明顯的種間差異。其中SE和BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)周期較長,藻細(xì)胞培養(yǎng)12d后才進(jìn)入生長平臺(tái)期;HSM1和DS培養(yǎng)基,小球藻生長5~6d就進(jìn)入生長平臺(tái)期,但是生物量不高;SE培養(yǎng)基培養(yǎng)能帶來較高的生物量,細(xì)胞干重為0.53~0.73g/L,適合高密度培養(yǎng);HSM1培養(yǎng)基培養(yǎng)則有著較快的生長速度,相對(duì)生長速率在1.19~1.57之間,適合快速培養(yǎng)。從油脂的累積規(guī)律來看,油脂的快速積累一般發(fā)生在藻細(xì)胞生長到平臺(tái)期和平臺(tái)后期時(shí),并且在后期表現(xiàn)出較大的種間差異,其中DS培養(yǎng)基更適合小球藻油脂的累積。根據(jù)目前對(duì)缺氮和缺鐵條件促進(jìn)微藻油脂積累的相關(guān)研究推測,油脂過度積累可能屬于一種抗逆生理反應(yīng),以積累儲(chǔ)能物質(zhì)度過不利環(huán)境。在DS和HSM1培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下,細(xì)胞生長很早進(jìn)入平臺(tái)期,到平臺(tái)后期時(shí)細(xì)胞處于一種不利于其生長的環(huán)境狀態(tài),所以三種小球藻在DS和HSM1培養(yǎng)基中油脂的累積水平高于其它2種培養(yǎng)基。其中藻株ChlorellavulgarisY-019的油脂積累量又顯著高于ChlorellavugarisFACHB-31和ChlorellapyrenoidosaY-041,積累狀況最為理想,但如何協(xié)調(diào)其生長與油脂的累積則有待于進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)采用小球藻藻株:ChlorellavugarisFACHB-31購自中國科學(xué)院水生生物研究所,Y-019和Y-041藻株于2008年11月至2009年3月采自?？谥苓厽釒У?通