生物化學技術(shù)6-凝膠過濾11市公開課獲獎?wù)n件省名師優(yōu)質(zhì)課賽課一等獎?wù)n件

第六章凝膠過濾1/70

凝膠過濾是20C-60Y發(fā)展起來一個分離純化方法；又稱分子篩層析、排阻層析

原理：凝膠含有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，小分子物質(zhì)能進入其內(nèi)部，而大分子物質(zhì)卻被阻擋在外部，從而使混合溶液中各種組分按分子質(zhì)量不一樣進行篩分

特點：設(shè)備簡單，操作方便、重復性好、回收率高

用途：分離純化蛋白質(zhì)、核酸、多糖、激素等，測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量、樣品濃縮和脫鹽等

2/70目掌握凝膠分類和性質(zhì)掌握凝膠過濾基本原理熟悉凝膠過濾操作與應用3/70第一節(jié)凝膠分類及性質(zhì)

4/70

凝膠是一類不溶于水，但在水中有較大膨脹度和很好分子篩作用化合物當前主要有葡聚糖凝膠、天然瓊脂糖和交聯(lián)瓊脂糖；其次，還有聚丙烯酰胺凝膠（生物膠）、交聯(lián)葡聚糖與雙丙烯酰胺共聚凝膠，以及交聯(lián)瓊脂糖與葡聚糖共價結(jié)合凝膠等5/706/707/70

商品名稱：Sephadex，由葡聚糖[右旋糖酐(G型)]和3-氯-1，2環(huán)氧丙烷(交聯(lián)劑)以醚鍵交聯(lián)而成在交聯(lián)葡聚糖G-25、G-50中加入羥丙基后，即可組成烷基化（LH型）葡聚糖凝膠一、葡聚糖凝膠8/709/70①性狀：外觀為白色珠狀顆粒，在顯微鏡下可見表面為網(wǎng)狀皺紋②溶解性：帶有大量羥基，親水性好，所以在水溶液或電解質(zhì)溶液中極易膨脹③型號：SephadexG-n（n越大，則交聯(lián)度越小，而膨脹度、吸水量和篩孔直徑則越大④應用：1.理化性質(zhì)凝膠過濾層析：以G型Sephadex為固定相，水為流動相，對水溶性物質(zhì)進行分離凝膠滲透層析：以LH型Sephadex為固定相，以有機溶劑為流動相，對脂溶性物質(zhì)進行分離10/70

在水溶液、鹽溶液、堿溶液、弱酸溶液和有機溶劑中是穩(wěn)定、不溶解

強酸或氧化劑溶液時，則輕易使糖苷鍵水解斷裂在室溫下長久保留時，應加入適量防腐劑如CHCl3、0.05％NaN3或20％EtOH等

2.穩(wěn)定性11/70

含少許羧基基團，為弱酸性物質(zhì)。能與帶正電荷分離物如堿性蛋白質(zhì)等發(fā)生吸附

克服方法：提升洗脫液離子強度至0.05以上，可克服此非特異性吸附

①慣用含有NaCl緩沖液作洗脫液。

②新購得葡聚糖凝膠對蛋白質(zhì)往往有不可逆吸附性能，即使吸附數(shù)量較少，但在定量測定或者分離純化極難得到物質(zhì)時，也需先用易得到蛋白質(zhì)進行預層析，方便消除其影響3.吸附性12/70

葡聚糖凝膠對芳香族化合物或雜環(huán)化合物以及一些凝集素含有較強吸附作用，若采取凝膠過濾層析分離它們時，往往利用是吸附性能，而不是排阻原理

13/7014/70

瓊脂糖是從瓊脂中分離出來一個由D-半乳糖和3,6脫水L-半乳糖連接而成多糖。其商品名因生產(chǎn)廠家不一樣而異瑞典、中國：Sepharose美國：Bio-gelA15m，排阻分子量小于15million分子，即15×106（排阻程度）

英國：Segavac，粉狀、顆粒狀丹麥：Gelarose

除Segavac外，都是以珠狀瓊脂糖凝膠形式出售

二、瓊脂糖凝膠15/701.性質(zhì)①高溫時呈液態(tài)，經(jīng)凝集即成瓊脂糖凝膠②對尿素、鹽酸胍等含有較強抵抗力，在pH4.0~9.0緩沖液中穩(wěn)定③層析流速較高④干膠易脫水破裂，普通存放于含防腐劑水溶液中，防止猛烈攪拌16/70①Sepharose2B(2％)、4B(4％)和6B(6％)Sepharose6B機械強度大于2B，不過篩孔小于2B②Sepharose與1，3-二溴異丙醇(1,3-dibromopropanol)在強堿性條件下反應后，即生成CL型交聯(lián)瓊脂糖(SepharoseCL）

這種瓊脂糖篩孔與同濃度、未交聯(lián)瓊脂糖相同，但耐熱、耐酸堿。不過在氧化劑存在下，會有少許多糖鏈發(fā)生解聚（穩(wěn)定性提升）

2.應用形式（按濃度分）17/703.特點機械強度和篩孔穩(wěn)定性都比葡聚糖凝膠好；且層析時流速較快18/70

商品名稱：Bio-gel（生物膠）。以甲撐雙丙烯酰胺(雙體)作交聯(lián)劑，以過硫酸銨作催化劑，在N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TEMED)加速劑作用下（化學催化），將丙烯酰胺(單體)聚合而成當改變單體濃度時，就可得到吸水率不一樣產(chǎn)物。商品聚丙烯酰胺凝膠型號有Bio-gelP-2到P-300，其阿拉伯數(shù)字表示排阻程度

如Bio-gelP-150排阻程度為小于150×103Da三、聚丙烯酰胺凝膠19/70

聚丙烯酰胺凝膠普通制成珠狀顆粒，使用前必須溶脹。能忍受濃鹽、尿素和胍鹽等溶液浸泡；耐酸堿，但要防止長久與強酸和強堿接觸，假如與其接觸并在高溫條件下，酰胺基將快速發(fā)生分解聚丙烯酰胺凝膠對芳香族、酸性和堿性化合物稍有吸附現(xiàn)象克服吸附方法：提升洗脫液離子強度

20/70

Sephacryl是由烯丙烷基葡聚糖與甲撐雙丙烯酰胺共價交聯(lián)制成。此凝膠屬硬性凝膠，它含有一定大小篩孔和少許羧基基團耐酸堿、耐去污劑、耐解離劑，甚至可用去污劑、鹽酸胍或尿素溶液作洗脫劑多用于蛋白質(zhì)、核酸、多糖和蛋白聚糖分離純化，也用于病毒顆粒分離四、Sephacryl21/70

由高交聯(lián)度瓊脂糖與葡聚糖共價結(jié)合而成特點：含有良好分子篩特征和理化穩(wěn)定性。溶液酸堿度可在pH3~12范圍內(nèi)改變；溶液中加入去污劑(如1％SDS)和(或)解離劑(如8mol/L尿素、6mol/L鹽酸胍)時，也不會影響分離效果

五、Superdex22/70Superose：高交聯(lián)度多孔瓊脂糖珠玻璃珠：有大量網(wǎng)孔，且分布均一。機械性能良好，在較高層析流速下，分辨率并不受影響，其缺點是對蛋白質(zhì)等物質(zhì)有吸附能力聚苯乙烯凝膠五、其他23/70第二節(jié)基本原理24/70一、基本原理

凝膠過濾層析所用基質(zhì)是含有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、篩孔直徑較一致，且呈珠狀顆粒物質(zhì)。這種物質(zhì)可完全或部分排阻一些大分子化合物于篩孔之外，而小分子化合物則能夠在篩孔中自由擴散和滲透。某種組分凝膠層析柱中被排阻程度用表示

洗脫體積；外水體積；凝膠床體積

在一定層析條件下，和均為固定值，而伴隨被分離物分子量改變而改變。組分分子量越大，則洗脫更輕易（排阻越多），越小，越小25/70

各組分間值差異越大，分離效果越好；差異越小,則分離效果很差，或根本無法分離流出物用部分搜集器等量或等時搜集，檢測后分段合并相同組分各管流出物，得到分子量不一樣各種組分26/70

1、當Kav=0時，則Ve=Vo，即對于根本不能進入凝膠內(nèi)部大分子物質(zhì)全排阻，洗脫體積等于空隙體積即外水體積（圖中組分Ⅰ）2、當Kav=1時，Ve=Vo+Vi。即小分子可完全滲透凝膠內(nèi)部時，洗脫體積應為空隙體積與內(nèi)水體積之和。Ve=Vo+Vi（圖中組分Ⅲ）27/703、當0＜Kav＜1時，Ve=Vo+Kav（Vi＋Vg）。表示固定相中只有一部分可被組分擴散滲透，一部分被排阻，Ve即在Vo與Vo+Vi＋Vg之間改變（圖中組分Ⅱ）4、有時Kav＞1，表示凝膠對組分有吸附作用（從內(nèi)水中洗脫出來含量下降），此時Ve＞Vo+Vi＋Vg。比如一些芳香族化合物如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸等在SephadexG-25中洗脫體積遠超出理論計算最大值28/70二、值測定只要測出、和，即可計算出值測定：（1）計算法：（2）測定法：29/70

測定：用藍色葡聚糖（M=200萬），在Sephadex中被完全排阻，并借助其本身顏色，采取肉眼或分光光度計檢測（210、260或620nm）洗脫體積測定：用、N-乙酰酪氨酸或其它小分子物質(zhì)作為洗脫對象。因為分子量小，且無吸附，故洗脫體積剛好是（=1）當分子大小在凝膠孔徑上、下限之間時，則介于和之間（即=0~1）30/7031/70第三節(jié)操作32/70（一）凝膠選擇

1.型號：凝膠型號不一樣，篩分范圍亦不相同如：SephadexG型多用于分離蛋白質(zhì)；生物膠和Sephacryl等多用于分離核酸；要除去蛋白質(zhì)中鹽類，多用SephadexG-252.粒度：粒度與交聯(lián)度無關(guān)。與粗顆粒相比，細顆粒凝膠之間空間小，裝柱易均勻，分離效果好，但流速慢；而粗顆粒凝膠流速快，宜用小顆粒直徑層析柱

一、凝膠選擇與處理33/7034/70（二）凝膠用量計算

因為凝膠在處理過程中會有一部分損失，故用此法計算出凝膠用量需增加10~20%35/70（三）凝膠處理將所用干膠置于5~10倍量D.W中，充分浸泡（表6-2溶脹時間），用傾斜法去除表面懸浮小顆粒，再用0.5mol/LNaOH-0.5mol/LNaCl室溫浸泡0.5h，抽濾除去堿液，用D.W洗至中性。再用抽氣方法以D.W或平衡液除去凝膠顆粒之間氣泡36/701．柱子選擇①當直徑相同時，柱長長者比柱長短者分辨率高②柱長相同時，直徑大者比小者分辨率高③床體積相同時，柱長長者比短分辨率高

普通理想層析柱直徑與長度之比是1：25~1：100；層析柱外面最好有夾套，能控制溫度（柱溫箱），以確保結(jié)果重復性2．裝柱：慣用濕裝法（第三章）3．凝膠柱判定

二、凝膠柱制備37/70流速、柱長對分離影響

38/70加樣量與層析柱床體積及檢測方法靈敏度相關(guān)。床體積越小、方法靈敏度越高時，加樣量越少層析目標在于分析時，加樣量占床體積1～2％，作制備、脫鹽用時，占20～30％普通來說，加樣量越少，分辨率越高。詳細加樣體積由分配系數(shù)(Kav)或洗脫體積(Ve)來決定三、加樣與洗脫（一）加樣39/7040/70

VeA、VeB：組分A、B洗脫體積

KavA、KavB：組分A、B分配系數(shù)Vs：A、B兩組分洗脫體積之差（又稱為分離體積）Vs=VeA－VeB

當樣品體積Vp＝Vs時，理論上洗脫圖形是兩種物質(zhì)恰好分開(圖中Ⅲ)。但因為樣品流過柱時擴散作用，其體積會逐步增大，致使其洗脫體積遠比原來大加樣量（Vp）確定41/70

圖Ⅱ、Ⅲ中A、B兩種物質(zhì)有一定程度交叉，這表明二者只是部分分開。所以，當Vp等于或大于Vs時，A、B兩種物質(zhì)就不能完全分開(圖中Ⅱ)

當Vp＜Vs時，A、B兩種物質(zhì)就能分開(圖中Ⅰ)

依據(jù)Ve=Vo+Kav（Vt－Vo）又Vs=VeA－VeB

=（KavA－KavB）（Vt－Vo）42/70

Vs=（KavA－KavB）（Vt－Vo）=（KavA－KavB）（Vi+Vg）

A、B兩種物質(zhì)能分開最低限：Vp＝Vs最大Vs時必要條件：①KavA－KavB最大，為1－0＝1②Vi+Vg最大，普通為Vt/2則：最大理論加樣量Vp＝Vs＝Vt/2

最大理論加樣量計算43/70

為提升分離效果，除了縮小加樣體積以外，樣品黏度也普通以小于2cp(厘帕，P=N/m2·s)，或者與洗脫液黏度相當為宜葡聚糖使粘度上升

黏度影響44/70粘度對柱層析影響

45/701.洗脫液選擇標準

能溶解被洗脫物質(zhì)而又不使其變性或失活普通以單一緩沖液（如PBS、Tris-HCl緩沖液等）或鹽溶液，有時甚至用D.W作為洗脫液2.洗脫速度

若流速不均勻，搜集每一部分洗脫體積不恒定，Kav就難以確定最好裝置是恒流泵(微量泵、蠕動泵)，能夠使流速在較大范圍內(nèi)恒定。若無此裝置，可用控制操作壓方法進行，其裝置可使用恒壓瓶

普通，洗脫速度慢，分離效果就好；但若太慢，由會因擴散加劇而影響分離效果(二)洗脫46/70。47/70

SephadexG-50及其以下（交聯(lián)度大）流速與操作壓之間關(guān)系恪守Darcy’s規(guī)律u：線性流速(ml/cm2·h)K：常數(shù)(粗、中、細顆粒各不相同)△P：操作壓(cp)L：柱長流速與操作壓48/70

Ko僅與凝膠性質(zhì)相關(guān)，而與柱子直徑基本無關(guān)。不過G-75以上各種型號交聯(lián)葡聚糖流速還與柱直徑大小相關(guān)

當洗脫液黏度為lcp時表示式49/7050/70

普通，洗脫流速慢，則分離效果就好；但太慢又會因擴散加劇而影響分離效果51/70四、凝膠柱再生及保留（一）再生

使用過一次或幾次凝膠柱，通慣用3～4倍床體積洗脫液沖洗，再用平衡液平衡即可；但使用過屢次后，凝膠床體積變小、流動速度下降、雜質(zhì)過多等，其處理方法是

①先用水重復進行逆向沖洗（反沖），再用緩沖液進行平衡；

②把凝膠倒出，用低濃度酸或堿按其預處理方法進行處理，然后重新裝柱52/70①膨脹狀態(tài)即在水相中保留。可加入0.02%疊氮鈉（NaN3）溶液等防腐劑或加熱滅菌后于低溫短時間保留。普通不用氯仿、丁醇、甲苯等為防腐劑。因為它們能引發(fā)凝膠顆粒收縮，同時還能進入層析儀器塑料部件，使塑料變軟，造成不良后果（二）保存53/7054/70②半收縮狀態(tài)：

用完后水洗凈，然后再用60%～70%乙醇洗，則凝膠體積縮小，于低溫較長時間保留③干燥狀態(tài)：

用水洗凈后，加入含乙醇水洗，并逐步加大含醇量，最終用95%乙醇洗，則凝膠脫水收縮，再用乙醚洗去乙醇，抽濾至干，于60～80℃烘干后長時間保留

不脫水而直接烘干會黏結(jié)成塊

55/70第四節(jié)應用56/70原理：鹽類小分子物質(zhì)進入凝膠篩孔，而大分子物質(zhì)則被排阻在外（分子篩原理）優(yōu)點：與透析相比，速度快，不會引發(fā)大分子物質(zhì)變性材料：細顆粒葡聚糖凝膠G-25

一、脫鹽和濃縮57/70分離對象：溶解度、帶電性等理化性質(zhì)相同而分子質(zhì)量不同，或者是聚合度不等混合物溶液實例：SephadexG-200層析純化AFP制備Ag-Ab復合物溶于少許0.1mol/LGly-HCl緩沖液中，并用本液透析2h上SephadexG-200柱得AFP峰置0.1mol/L檸檬酸-磷酸緩沖液（pH4.8）透析上柱洗脫AFP純品二、分離生命物質(zhì)58/7059/7060/70熱源物質(zhì)：指微生物產(chǎn)生分子量很大一些多糖蛋白復合物等，能使人體發(fā)燒物質(zhì)材料：SephadexG-25（80~120目）特點：比活性炭吸附、離子交換吸附等方便

實例：用SephadexG-25凝膠層析除去氨基酸粗品中熱源質(zhì)：利用熱源（大分子蛋白類）Kav=0，而氨基酸Kav≈1，將試劑量控制在柱體積20~30%，能實現(xiàn)完全分離三、去熱源物質(zhì)61/70原理：Kav=－blgM+c或lgM=a－dKav(M為分子質(zhì)量，常數(shù)a、b、c、d均大于0)先做標準曲線，再在相同條件下測樣品Kav也可用以下4個指標代替①Ve－Vo：分離體積②Ve/Vo：相對保留體積（另R＝Vo/Ve）③Ve/Vt：簡化洗脫體積，受柱填充情況影響較?、躒e：洗