核酸的分離與純化課件

核酸的分離純化核酸的分離純化1主要內(nèi)容

前言1核酸分離、純化原則1.1保持核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性1.2.防止核酸的生物降解2分離提取核酸的主要步驟2.1細(xì)胞的破碎2.2核蛋白的解聚、變性蛋白的去除2.3核酸的沉淀2.4核酸的濃度測(cè)定2.5核酸的保存主要內(nèi)容前言2

核酸（nucleicacid）是遺傳信息的攜帶者，是基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)。無(wú)論是進(jìn)行核酸結(jié)構(gòu)還是功能研究，首先需要對(duì)核酸進(jìn)行分離和純化。核酸樣品質(zhì)量將直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。前言Home核酸（nucleicacid）是遺傳信息的攜帶者，是31核酸分離、純化原則1.1保持核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性1.1.1意義：遺傳信息全部?jī)?chǔ)存在一級(jí)結(jié)構(gòu)之中，核酸的—級(jí)結(jié)構(gòu)還決定其高級(jí)結(jié)構(gòu)的形式以及和其他生物大分子結(jié)合的方式。1.1.2分離核酸原則：

1）溫度不要過(guò)高；

2）控制pH值范圍(pH值5-9);

3）保持一定離子強(qiáng)度;

4）減少物理因素對(duì)核酸的機(jī)械剪切力.Home1核酸分離、純化原則1.1保持核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性41.2防止核酸的生物降解細(xì)胞內(nèi)或外來(lái)的各種核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)。所用器械和一些試劑需高溫滅菌，提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑。1.2防止核酸的生物降解細(xì)胞內(nèi)或外來(lái)的各種核酸酶能51.2.1DNA酶抑制劑(1）金屬離子螯合劑：DNA酶需要金屬二價(jià)離子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金屬二價(jià)離子螯合劑，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二鈉)、8-羥基喹啉；(2）陰離于型表面活性劑：如SDS，該試劑除對(duì)核酸酶有抑制作用外，還能使蛋白質(zhì)變性，并與變性蛋白結(jié)合成帶負(fù)電荷的復(fù)合物，該復(fù)合物在高鹽溶液中沉淀。1.2.1DNA酶抑制劑(1）金屬離子螯合劑：61.2.2RNA酶（RNAase)抑制劑RNAase分布廣泛，極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸、耐堿，不宜失活。(1)皂土（bentonite）作用機(jī)制：皂土帶負(fù)電荷，能吸附RNase，使其失活。1.2.2RNA酶（RNAase)抑制劑R7(2)DEPC(二乙基焦碳酸鹽)(C2H5OCOOCOOC2H5)粘性液體，很強(qiáng)的核酸酶抑制劑。

作用機(jī)制：與蛋白質(zhì)中His結(jié)合使蛋白變性。

使用注意：

1）DEPC也能破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤環(huán)。但濃度比使蛋白質(zhì)變性的濃度大100～1000倍。2）容易降解，保存在4℃或液氮中；3）提RNA時(shí)，0.1%DEPC浸泡器皿37℃2h。4）劇毒。(2)DEPC(二乙基焦碳酸鹽)(C2H5OCOO8（3)肝素（4）復(fù)合硅酸鹽（Macaloid)（5）RNase阻抑蛋白（RNasin）（6）氧釩核糖核苷復(fù)合物(Vanadyl-RibonucleosideComplex,VRC)Home（3)肝素Home9(1)高速組織搗碎機(jī)搗碎(2)玻璃勻漿器勻漿(3)超聲波處理法(4)液氮研磨法(5)化學(xué)處理法(SDS、LDS，吐溫80等）(6)生化法（溶菌酶、纖維素酶等）Home2.1細(xì)胞的破碎(1)高速組織搗碎機(jī)搗碎Home2.1細(xì)胞的破碎102.2核蛋白的解聚、變性蛋白的去除核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合力主要是正負(fù)靜電吸力(核酸與堿性蛋白的結(jié)合)、氫鍵和非極性的范德華力。分離核酸最困難的是將與核酸緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)分開(kāi)，同時(shí)避免核酸降解。2.2核蛋白的解聚、變性蛋白的去除112.2.1加入濃鹽溶液（如NaCl）核酸-蛋白質(zhì)加入NaCl后，破壞靜電吸力，使氫鍵破壞，核蛋白解聚；2.2.2加入SDSSDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，還具有使核酸從蛋白質(zhì)上游離出來(lái)的功能；

2.2.1加入濃鹽溶液（如NaCl）122.2.3酚/氯仿抽提

酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并對(duì)核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有機(jī)相與水相分層，減少殘留在水相中的酚，同時(shí)氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液時(shí)，需要振搖，為防止起泡和促使水相與有機(jī)相的分離，再加上一定量的異戊醇（酚：氯：異戊醇=25：24：1）。2.2.3酚/氯仿抽提13

(1）使用注意酚通常是透明無(wú)色的結(jié)晶，如果酚結(jié)晶呈現(xiàn)粉紅色或黃色，表明其中含有酚的氧化產(chǎn)物，例如醌、二酸等。變色的酚不能用于核酸抽提實(shí)驗(yàn)，因?yàn)檠趸锟善茐暮怂岬牧姿岫ユI。(2）安全操作酚腐蝕性很強(qiáng)，并可引起嚴(yán)重的灼傷，操作時(shí)應(yīng)戴手套。使用酚時(shí)應(yīng)注意Home(1）使用注意使用酚時(shí)應(yīng)注意Home142.3核酸的沉淀沉淀是濃縮核酸最常用的方法。優(yōu)點(diǎn)：①改變核酸的溶解緩沖液；②重新調(diào)整核酸的濃度；③去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。2.3核酸的沉淀沉淀是濃縮核酸最常用的方法。152.3.1核酸沉淀的鹽類(lèi)及濃度鹽貯存液濃度（mol/L)終濃度(mol/L)MgCl210.01NaAc3(pH5.2)0.3KAc3(pH5.2)0.3NH4Ac102.5NaCl50.2LiCl80.8

當(dāng)核酸溶液的pH值大于4時(shí)，核酸分子呈多聚陰離子狀態(tài)，它與1價(jià)或2價(jià)陽(yáng)離子形成的鹽在許多有機(jī)溶劑中不溶解，也不會(huì)被有機(jī)溶劑變性。2.3.1核酸沉淀的鹽類(lèi)及濃度鹽貯存液濃度（mol/L)162.3.2有機(jī)沉淀劑

（1）乙醇優(yōu)點(diǎn)：

對(duì)鹽類(lèi)沉淀少，沉淀中所含跡量乙醇易揮發(fā)除去，不影響以后實(shí)驗(yàn)。缺點(diǎn)：

需要量大，一般要求低溫操作。2.3.2有機(jī)沉淀劑（1）乙醇17（2）異丙醇優(yōu)點(diǎn)：需體積小，速度快，適于濃度低、體積大的DNA樣品沉淀。一般不需低溫長(zhǎng)時(shí)間放置。缺點(diǎn)：易使鹽類(lèi)、蔗糖與DNA共沉淀．異丙醇難以揮發(fā)除去。所以，最后用70％乙醇漂洗數(shù)次。（2）異丙醇優(yōu)點(diǎn)：18（3）聚乙二醇（PEG）優(yōu)點(diǎn)：可用不同濃度的PEG選擇沉淀不同相對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段。應(yīng)用6000相對(duì)分子質(zhì)量的PEG進(jìn)行DNA沉淀時(shí)，使用濃度與DNA片段的大小成反比。注意：PEG沉淀一般需加0.5mol/L的NaCl或10mmol/L的MgCl2。（3）聚乙二醇（PEG）優(yōu)點(diǎn)：19（4）精胺

精胺不是有機(jī)溶劑，但可快速有效沉淀DNA。

原理是：精胺與DNA結(jié)合后，使DNA在溶液中結(jié)構(gòu)凝縮而發(fā)生沉淀，并可使單核苷酸和蛋白質(zhì)雜質(zhì)與DNA分開(kāi)，達(dá)到純化DNA的目的。（4）精胺精胺不是有機(jī)溶劑，但可快速有效沉淀DNA。202.3.3核酸沉淀的溫度和時(shí)間一般強(qiáng)調(diào)，核酸沉淀在低溫長(zhǎng)時(shí)間下進(jìn)行。低溫長(zhǎng)時(shí)間沉淀，易導(dǎo)致鹽與DNA共沉淀，影響以后的實(shí)驗(yàn)。一般使用0℃冰水，10-15min，DNA樣品足可達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。Home2.3.3核酸沉淀的溫度和時(shí)間一般強(qiáng)調(diào)，核酸沉淀在低212.4核酸的濃度測(cè)定2.4.1紫外分光光度法測(cè)DNA和RNA的含量

前提：核酸樣品要較純，無(wú)顯著蛋白質(zhì)、酚、瓊脂糖及其他核酸污染。測(cè)定濃度應(yīng)大于0.25μg/ml。

結(jié)論：在波長(zhǎng)260nm紫外光下，1OD值的吸光度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50μg/ml；單鏈DNA為37μg/ml；RNA為40ug/ml。2.4核酸的濃度測(cè)定2.4.1紫外分光光度法測(cè)DN22紫外分光光度計(jì)測(cè)定核酸濃度的操作步驟a．吸取一定量的DNA樣品或RNA樣品，加水至特定體積后，轉(zhuǎn)入分光光度計(jì)的石英比色杯中。b．分光光度計(jì)先用一定量的水校正零點(diǎn)。c．測(cè)定待測(cè)樣品在230nm、260nm和280nm的OD值。d．計(jì)算濃度。

雙鏈DNA樣品濃度(μg/μl)=OD260×核酸稀釋倍數(shù)×50/1000；RNA樣品濃度(μg/μl)=OD260×核酸稀釋倍數(shù)×40/1000。e．分析純度。紫外分光光度計(jì)測(cè)定核酸濃度的操作步驟a．吸取一定量的DNA23A：測(cè)DNA：

純的DNA樣品OD260/OD280應(yīng)為1.8，OD260m／OD230應(yīng)大于2.0。1)OD260/OD280大于1.9時(shí)，表明有RNA污染。2)小于1.6時(shí)，表明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚污染；3)OD260/OD230小于2.0時(shí)，表明溶液中有殘存的鹽和小分子雜質(zhì)，如核苷酸、氨基酸、酚等。注：可能出現(xiàn)既含蛋白質(zhì)又含RNA的DNA溶液比值為1.8的情況。測(cè)定結(jié)果分析A：測(cè)DNA：測(cè)定結(jié)果分析24B：測(cè)RNA純的RNA樣品其OD260／OD280應(yīng)介于1.7-2.0之間，OD260/OD230比值應(yīng)大于2.0。1）若RNA樣品OD260/OD280比值太小，說(shuō)明有蛋白質(zhì)或酚的污染；2）比值大于2.0時(shí)，可能被異硫氰酸胍等污染；3）OD260/OD230比值小于2.0時(shí)表明有小分子及鹽存在。B：測(cè)RNA252.4.2溴乙錠熒光法測(cè)定核酸的含量

原理：DNA、RNA在熒光染料溴乙錠(EB)嵌入堿基平面之間后，DNA、RNA樣品在紫外光激發(fā)下，可發(fā)出紅色熒光，熒光強(qiáng)度與核酸含量成正比。使用一系列已知的不同濃度DNA溶液作標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，可比較出被測(cè)DNA溶液濃度。

注意：此法的比較主要基于目測(cè)，是估計(jì)水平。Home2.4.2溴乙錠熒光法測(cè)定核酸的含量原理：DNA、RN262.5核酸的保存(1)對(duì)DNA

①DNA樣品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃保存；②長(zhǎng)期保存樣品中可加入1滴氯仿。(2)對(duì)RNA

①RNA樣品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或雙蒸滅菌水中，-70℃保存;

②長(zhǎng)期保存可以沉淀形式貯于乙醇中;

③在RNA溶液中，加1滴0.2mol/LVRC(氧釩核糖核苷復(fù)合物)凍貯于-70℃,可保存數(shù)年。Home2.5核酸的保存(1)對(duì)DNAHome27基因組DNA的分離純化基因組DNA特點(diǎn)：線性DNA，長(zhǎng)度長(zhǎng)，在溶液中黏稠，沉淀后難溶解，易斷裂基因組DNA的分離純化基因組DNA特點(diǎn)：線性DNA，長(zhǎng)度長(zhǎng)，28基因組DNA的分離純化酚抽提法：以含EDTA，SDS及無(wú)DNA酶的RNA酶裂解緩沖液裂解細(xì)胞，再經(jīng)蛋白酶K處理，以pH8.0Tris飽和酚抽提DNA，再根據(jù)需要純化及濃縮。甲酰胺解聚法：細(xì)胞裂解步驟與酚抽提法一致，但以高濃度甲酰胺裂解液裂解DNA與蛋白質(zhì)，再以透析除去雜質(zhì)基因組DNA的分離純化酚抽提法：以含EDTA，SDS及無(wú)DN29基因組DNA的分離純化玻璃棒纏繞法：將基因組DNA沉淀纏繞于帶鉤玻璃棒上帶出，溶于pH8.0的TE其他方法：異丙醇沉淀法，玻璃珠吸附法基因組DNA的分離純化玻璃棒纏繞法：將基因組DNA沉淀纏繞于30基因組DNA的分離純化DNA樣品的進(jìn)一步純化：透析，沉淀，電泳，選擇性沉淀片段回收：原則：提高回收率，去除雜質(zhì)污染從瓊脂糖凝膠中回收：DEAE纖維素膜插片電泳法，電泳洗脫法，冷凍擠壓法從聚丙烯酰胺凝膠中回收：壓碎與浸泡基因組DNA的分離純化DNA樣品的進(jìn)一步純化：透析，沉淀，電31質(zhì)粒DNA的提取和純化質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)：超螺旋，半開(kāi)環(huán)，線性DNA理化性質(zhì)：與一般核酸相似，但抗切割和抗變性能力更強(qiáng)質(zhì)粒DNA的提取和純化質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)：超螺旋，半開(kāi)環(huán)，線性DNA32質(zhì)粒DNA的提取和純化方法：堿裂解法；煮沸裂解；羥基磷灰石柱層析法，質(zhì)粒DNA釋放法；酸酚法等。堿裂解法有操作簡(jiǎn)便、快速、得率高的優(yōu)點(diǎn)。概括起來(lái)主要是用非離子型或離子型去污劑、有機(jī)溶劑或堿進(jìn)行處理及用加熱處理所有分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)菌；分離質(zhì)粒DNA(有時(shí)還要求純化質(zhì)粒DNA，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需)選擇哪一種方法主要取決于以下幾個(gè)因素：質(zhì)粒的大小、大腸桿菌菌株、裂解后用于純化的技術(shù)和實(shí)驗(yàn)要求。質(zhì)粒DNA的提取和純化方法：堿裂解法；煮沸裂解；羥基磷灰石柱33堿裂解法堿法提取主要是利用共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來(lái)分離它們，在堿性pH，DNA變性，恢復(fù)中性時(shí)，線性染色體DNA不能準(zhǔn)確復(fù)性，與其它大分子共沉淀，而質(zhì)粒DNA卻可以準(zhǔn)確復(fù)性，留在上清中。堿性下，變性蛋白是可溶的，酸性、中性下變性蛋白不溶而沉淀。幾乎所有純化質(zhì)粒的方法都用到質(zhì)粒DNA分子相對(duì)較小和共價(jià)閉合環(huán)狀這兩個(gè)特性。由于操作原因提取的質(zhì)?？捎腥N結(jié)構(gòu)：超螺旋、開(kāi)環(huán)和復(fù)制中間體（即沒(méi)有復(fù)制完全的兩個(gè)質(zhì)粒連在了一起）

堿裂解法堿法提取主要是利用共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在拓?fù)?4

堿裂解法流程圖對(duì)數(shù)期菌體溶液III中和溶液I充分重懸溶液II裂解上清液抽提離心洗滌乙醇沉淀干燥溶解沉淀質(zhì)粒DNA溶液堿裂解法流程圖對(duì)數(shù)期菌體溶液III中和溶液I充分重懸溶液I35堿裂解法（一）儀器：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、臺(tái)式離心機(jī)、高壓滅菌鍋（二）材料：含有質(zhì)粒的大腸桿菌、LB液體培養(yǎng)基（三）試劑：溶液I50mM葡萄糖25mMTris·HCl（pH8.0）10mMEDTA作用:分散細(xì)胞，鰲合金屬離子使金屬酶失活溶液II0.2MNaOH1%SDS（新鮮配制）作用:細(xì)胞壁肽聚糖堿性下水解,核酸和蛋白質(zhì)變性。溶液III5MKAC：乙酸鉀：冰乙酸：水，按6：1.15：2.85混合作用:酸性下質(zhì)粒DNA復(fù)性，變性蛋白－SDS＋線性DNA沉淀，K＋可中和DNA堿裂解法（一）儀器：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、臺(tái)式離心機(jī)、高壓滅36堿裂解法平衡酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）作用：氯仿可使蛋白質(zhì)變性并有助于液相與有機(jī)相的分離。平衡酚pH7.8（DNA分配于有機(jī)相，酚的密度大），可使DNA在上清中。異戊醇有助于消除抽提過(guò)程中出現(xiàn)的泡沫）注：用時(shí)取下層液，酚腐蝕性強(qiáng)，可引起灼傷。無(wú)水乙醇：除去DNA水化層，使DNA沉淀TE緩沖液：溶解DNA堿裂解法平衡酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）37堿裂解法

1、取1.5ml培養(yǎng)液倒入1.5mleppendorf管中,4℃下12000g離心30秒。

2、棄上清,將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘,使液體流盡。

3、菌體沉淀重懸浮于100μl溶液Ⅰ中(需劇烈振蕩),室溫下放置5-10分鐘。

4、加入新配制的200μl溶液Ⅱ,蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數(shù)次,以混勻內(nèi)容物(千萬(wàn)不要振蕩),冰浴