海南瓜絹螟種群對(duì)藥劑的敏感性測(cè)定

海南瓜絹螟種群對(duì)藥劑的敏感性測(cè)定

絲綢蟲(chóng)、條紋蟲(chóng)、東方蟲(chóng)和絲綢蟲(chóng)。主要分布在亞太地區(qū)和非洲,在我國(guó)華東、華中、華南和西南各省均有分布。瓜絹螟以幼蟲(chóng)取食寄主的葉、花和嫩芽,或蛀食果實(shí)、莖桿或葉柄;寄主有黃瓜、絲瓜、西瓜、常春藤、冬葵、大豆、棉等。近年來(lái),該蟲(chóng)在我國(guó)不少地區(qū)為害日趨嚴(yán)重并已上升為葫蘆科蔬菜的主要害蟲(chóng),經(jīng)常暴發(fā)成災(zāi),嚴(yán)重影響當(dāng)?shù)毓喜俗魑锏纳a(chǎn)。在海南瓜絹螟一年四季均有為害,在儋州、樂(lè)東、澄邁以為害黃瓜最嚴(yán)重,在文昌、瓊海等地嚴(yán)重危害西瓜。絲瓜、苦瓜、冬瓜等葫蘆科作物也普遍受害。目前對(duì)瓜絹螟的防治主要是采用化學(xué)防治,過(guò)多的使用化學(xué)農(nóng)藥已使瓜絹螟產(chǎn)生抗藥性。王小藝等于1998年對(duì)廣州郊區(qū)黃瓜上的瓜絹螟的室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果表明,樂(lè)果、魚(yú)藤酮、Bt對(duì)瓜絹螟的毒殺作用,和茶皂素對(duì)這3種農(nóng)藥增效作用及茶皂素單劑對(duì)瓜絹螟的拒食作用在常規(guī)用量下已基本失效。在海南各地普遍反映常用藥劑對(duì)瓜絹螟的防治越來(lái)越差,使用常用農(nóng)藥防治越來(lái)越困難等。而除此之外,有關(guān)瓜絹螟種群抗藥性檢測(cè)、生化分析等方面的探討研究等均少有報(bào)道,尤其對(duì)于熱帶地區(qū)的瓜絹螟的研究則是更少。三氟氯氰菊酯、辛硫磷、阿維菌素是海南等地用于防治瓜絹螟等蔬菜害蟲(chóng)的藥劑,筆者測(cè)定了瓜絹螟對(duì)上述3種殺蟲(chóng)劑的敏感性及其在海南的儋州、樂(lè)東、澄邁等地區(qū)間的變化,為瓜絹螟的抗藥性提供預(yù)警,并測(cè)定比較3地區(qū)瓜絹螟種群的乙酰膽堿酯酶、羧酸酯酶、多功能氧化酶等酶系的比活力及其差異,分析瓜絹螟對(duì)供試藥劑敏感性與所測(cè)定酶系比活性的關(guān)系,為了解瓜絹螟對(duì)藥劑敏感性變化的生化機(jī)制及瓜絹螟有效防治提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1黑黃瓜葉的飼養(yǎng)及配制分別從儋州、樂(lè)東、澄邁3個(gè)地區(qū)的黃瓜地采回瓜絹螟幼蟲(chóng),于室內(nèi)自然條件下進(jìn)行人工飼養(yǎng)。將采回的幼蟲(chóng)置于直徑為15cm的培養(yǎng)皿用新鮮黃瓜葉進(jìn)行飼養(yǎng),直至化蛹,羽化為成蟲(chóng)后,進(jìn)行雌雄配對(duì),用100g/L蔗糖水來(lái)為其補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)。選用F1代發(fā)育一致、蟲(chóng)體均勻、體重在0.014～0.019g/頭的4齡的幼蟲(chóng)進(jìn)行測(cè)定。1.1.2其它常用生物化學(xué)試劑硫代乙酰膽堿氯化鹽Acetylthiocholine(Sigma公司),毒扁豆堿PHysostigmine(ALEXIS公司),二硫雙對(duì)硝基苯甲酸DTNB(Cayman公司),還原型谷胱甘肽Glutathione(上海生物化學(xué)試劑商店,進(jìn)口分裝),對(duì)硝基苯甲醚(Flucka公司),固蘭鹽B(Flucka進(jìn)口分裝),a-乙酸奈酯、還原型輔酶ⅡNADPH、a-奈酚(上海化學(xué)試劑公司),其它常用化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?.1.3辛硫磷紅重質(zhì)乳油公司三氟氯氰菊酯cyhalothain:質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.07%原藥,白色粉末,安徽省寧國(guó)市農(nóng)藥化工總廠;辛硫磷phoxim:質(zhì)量分?jǐn)?shù)90%原藥,紅棕色乳油,山東和樂(lè)集團(tuán)化工有限公司(原山東樂(lè)陵農(nóng)藥廠);阿維菌素abamectin:質(zhì)量分?jǐn)?shù)90%原藥,白色粉末,江蘇省射陽(yáng)化工廠。1.1.4實(shí)驗(yàn)儀器和儀器毛細(xì)管點(diǎn)滴器(1.106μL),微量移液器(GilsonMedicalElectronincs(France)S.A.),人工氣候箱(LRH-250GS型廣東省醫(yī)療器械廠),電子天平(上海天平廠),臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Hettich公司EBA12R型),恒溫水浴鍋(HWS上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、可控振蕩器(上海環(huán)球物化儀器廠),分光光度計(jì)(PERKINELMER公司)等。1.2方法1.2.1培養(yǎng)液溫度和濕度對(duì)死亡率的測(cè)定采用文獻(xiàn)FAO推薦的微量點(diǎn)滴法,將1.106μL殺蟲(chóng)劑溶液點(diǎn)滴于每頭幼蟲(chóng)的胸部背面,對(duì)照用丙酮溶液處理。試蟲(chóng)經(jīng)處理后放入直徑為15cm的培養(yǎng)皿中,每皿10頭,飼以新鮮黃瓜葉,保溫于光照培養(yǎng)箱(溫度(24±1)℃,濕度80%～90%,光照12L/12D)。24h后檢查死亡率(檢查標(biāo)準(zhǔn):以針頭反復(fù)挑刺蟲(chóng)體,在日光燈下觀察,蟲(chóng)仍然不動(dòng)者判斷為死亡)。按Abbott公式計(jì)算校正死亡率。將處理劑量對(duì)數(shù)值作為X,校正死亡率機(jī)率值(查機(jī)率值表)為Y,利用Excel軟件進(jìn)行數(shù)值回歸,求其毒力直線方程及LD50值,并求其95%的置信區(qū)間。1.2.2乙酰膽堿酯酶的活性1.2.2.1.酶源制備1.2.2.2.酶活性試驗(yàn)1.2.3丙烯酸酶活性測(cè)定1.2.3.1.酶源制備1.2.3.2.酶活性試驗(yàn)1.2.4多因素氧化活動(dòng)1.2.4.1.酶源制備1.2.4.2.酶活性試驗(yàn)2結(jié)果與分析2.1種瓜東南角種的毒力測(cè)定3種供試殺蟲(chóng)劑對(duì)儋州、樂(lè)東、澄邁地區(qū)的瓜絹螟的毒力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn),三氟氯氰菊酯、辛硫磷、阿維菌素對(duì)3地區(qū)瓜絹螟的毒力測(cè)定結(jié)果均表現(xiàn)出地區(qū)間有明顯差異。三氟氯氰菊酯對(duì)3地區(qū)瓜絹螟的毒力測(cè)定結(jié)果反映為澄邁地區(qū)種群最不敏感,其次為樂(lè)東地區(qū),再其次為儋州地區(qū);辛硫磷對(duì)3地區(qū)瓜絹螟的毒力測(cè)定結(jié)果反映為澄邁地區(qū)種群最不敏感,其次為儋州地區(qū),再其次為樂(lè)東地區(qū);阿維菌素對(duì)3地區(qū)瓜絹螟種群的毒力測(cè)定結(jié)果反映為樂(lè)東地區(qū)種群最不敏感,其次為儋州地區(qū)種群,再其次為澄邁地區(qū)種群。以LD50值相比較,阿維菌素對(duì)3地區(qū)種群的LD50差異最大,最不敏感種群(樂(lè)東)與最敏感種群(澄邁)的LD50比值為3.3548:1;其次為辛硫磷對(duì)3地區(qū)瓜絹螟種群的毒力差異,最不敏感種群(澄邁)與最敏感種群(樂(lè)東)的LD50比值為3.2913:1;三氟氯氰菊酯對(duì)3地區(qū)瓜絹螟種群的毒力地區(qū)差異最小,最不敏感種群(澄邁)與最敏感種群(儋州)的LD50比值為1.6708:1。2.2瓜誹螟的乙酰膽堿酯酶比活力海南儋州、樂(lè)東、澄邁3地區(qū)瓜絹螟的乙酰膽堿酯酶的比活力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明:澄邁地區(qū)瓜絹螟的乙酰膽堿酯酶比活力最高,其次為儋州地區(qū),再其次為樂(lè)東地區(qū),其酶比活力平均值分別為14.6605,8.5783,5.3804μmoL/(min.mg)。以測(cè)定的酶比活力平均值最小的為1,3地區(qū)的酶比活力比為澄邁:儋州:樂(lè)東=2.7248:1.5944:1。2.3羧酸酯酶比活力海南儋州、樂(lè)東、澄邁3地區(qū)瓜絹螟種群的羧酸酯酶比活力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明:澄邁地區(qū)瓜絹螟種群的羧酸酯酶比活力最高,其次是樂(lè)東地區(qū),再其次為儋州地區(qū),其酶比活力平均值分別為22.329,17.6215,8.0856μmoL/(min.mg)。以測(cè)定的酶比活力平均值最小的為1,3地區(qū)的酶比活力比為澄邁:樂(lè)東:儋州=2.7617:2.1794:1。2.4多功能氧化酶比活力海南儋州、樂(lè)東、澄邁3地區(qū)瓜絹螟種群的多功能氧化酶比活力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明:澄邁地區(qū)瓜絹螟的多功能氧化酶比活力最高,其次是儋州地區(qū),再其次為樂(lè)東地區(qū),其酶比活力平均值分別為8.8274,5.0647,3.3625umoL/(min.mg)。以測(cè)定的酶比活力平均值最小的為1,3地區(qū)的酶比活力比為:澄邁:儋州:樂(lè)東=2.6252:1.5062:1。2.5瓜東南角瓜扣留各各品種的酶系比活力的變化瓜絹螟對(duì)三氟氯氰菊酯、辛硫磷和阿維菌素的敏感性及它的乙酰膽堿酯酶、羧酸酯酶和多功能氧化酶等酶系比活性在海南澄邁、儋州和樂(lè)東3地區(qū)已產(chǎn)生一定程度的變化,其變化見(jiàn)圖1、2。不同地區(qū)種群對(duì)供試藥劑已具有不同的敏感性,敏感性強(qiáng)弱與其所測(cè)酶系比活性有關(guān)。2.5.13地區(qū)瓜絹螟藥劑敏感性的比較從圖1中可看出,澄邁地區(qū)瓜絹螟種群對(duì)三氟氯氰菊酯、辛硫磷的敏感性最差,而樂(lè)東地區(qū)瓜絹螟種群對(duì)阿維菌素的敏感性最低。2.5.23地區(qū)瓜絹螟各酶系比活性的比較從圖2中可以看出,乙酰膽堿酯酶、羧酸酯酶和多功能氧化酶等酶系的比活力在不同地區(qū)瓜絹螟中有明顯差異。3種酶的比活力均以澄邁地區(qū)種群的最高。澄邁、儋州和樂(lè)東的瓜絹螟的乙酰膽堿酯酶、羧酸酯酶和多功能氧化酶比活性的高低順序分別為澄邁>儋州>樂(lè)東、澄邁>樂(lè)東>儋州、澄邁>儋州>樂(lè)東。2.5.3瓜絹螟對(duì)各藥劑敏感性與其酶系比活性的關(guān)系從圖1、2可看出,澄邁、儋州和樂(lè)東3地區(qū)的瓜絹螟種群對(duì)三氟氯氰菊酯不敏感性的強(qiáng)弱順序與瓜絹螟的羧酸酯酶活性在3地區(qū)的高低順序是一致的,3地區(qū)瓜絹螟種群對(duì)辛硫磷的不敏感性的強(qiáng)弱順序與瓜絹螟的乙酰膽堿酯酶和多功能氧化酶活性在3地區(qū)的高低順序呈一致,但3地區(qū)瓜絹螟種群對(duì)阿維菌素的不敏感性的強(qiáng)弱順序與乙酰膽堿酯酶、羧酸酯酶和多功能氧化酶等酶系的比活力的變化趨勢(shì)不一致。從中可得出,瓜絹螟對(duì)三氟氯氰菊酯的不敏感性主要與羧酸酯酶比活性的提高有關(guān),而乙酰膽堿酯酶和多功能氧化酶比活性的改變是瓜絹螟對(duì)辛硫磷的敏感性變化的主要影響因素。乙酰膽堿酯酶、羧酸酯酶和多功能氧化酶比活性的改變不是瓜絹螟對(duì)阿維菌素的敏感性變化的主要原因。3測(cè)定和分析方法(1)本試驗(yàn)雖獲得了海南澄邁、儋州和樂(lè)東3地瓜絹螟種群對(duì)供試藥劑的LD50,但由于缺少瓜絹螟種群對(duì)供試藥劑的敏感度基線,本試驗(yàn)未能確定3地區(qū)瓜絹螟對(duì)三種供試藥劑抗藥性水平的高低,僅闡明了各地區(qū)的敏感性的差異。若以棉鈴蟲(chóng)敏感種群對(duì)三氟氯氰菊酯、辛硫磷的LD50為參考(棉鈴蟲(chóng)敏感種群對(duì)三氟氯氰菊酯、辛硫磷的LD50分別為0.070和0.870μg/g,海南瓜絹螟對(duì)三氟氯氰菊酯和辛硫磷等的抗性水平分別達(dá)44～73和8.7～14.42倍,說(shuō)明:海南瓜絹螟對(duì)三氟氯氰菊酯和辛硫磷等藥劑已具有一定的抗性風(fēng)險(xiǎn),澄邁地區(qū)種群尤為突出。瓜絹螟對(duì)阿維菌素的抗性風(fēng)險(xiǎn)以樂(lè)東地區(qū)種群最大,對(duì)此應(yīng)予重視,加強(qiáng)監(jiān)測(cè),并通過(guò)輪換用藥、使用混配劑等手段,降低藥劑對(duì)瓜絹螟的選擇壓力,減緩抗性的發(fā)生發(fā)展。(2)本試驗(yàn)的生測(cè)對(duì)象僅限海南的3地區(qū),華南、華東、西南等其它地區(qū)的瓜絹螟未能進(jìn)行測(cè)定,今后有待進(jìn)一步研究。(3)本試驗(yàn)僅對(duì)與昆蟲(chóng)解毒代謝或靶標(biāo)敏感性有關(guān)的乙酰膽堿酯酶、羧酸酯酶、多功能氧化酶的比活力進(jìn)行了測(cè)定,瓜絹螟對(duì)辛硫磷和三氟氯氰菊酯類(lèi)藥劑敏感性的改變與所測(cè)酶系活性的關(guān)系的研究結(jié)果與已有報(bào)道相一致。阿維菌素類(lèi)藥劑的作用主要是干擾昆蟲(chóng)體內(nèi)神經(jīng)末梢的信息傳遞,即激發(fā)神經(jīng)末梢放出神經(jīng)傳遞抑制素r-氨基丁酸(GABA),本試驗(yàn)未能對(duì)其進(jìn)行測(cè)試;對(duì)使害蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑敏感性下降的其它機(jī)制如昆蟲(chóng)表皮穿透性改變、谷光甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶等酶系比活性等也未做測(cè)定。這些均有待將來(lái)繼續(xù)探討。致謝中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保所蔣紅云教授為本實(shí)驗(yàn)提供了殺蟲(chóng)劑原藥,中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所陳青助理研究員為本實(shí)驗(yàn)提供了蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)方程,特此感謝。取幼蟲(chóng)頭部于0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.2)中,冰浴磨碎,4000r/min、0℃離心15min,取上清液作為酶源。每次每地區(qū)取30頭蟲(chóng)。參照文獻(xiàn)[6～10]高希武、陳長(zhǎng)琨等方法