原位PCR技術(shù)基本原理

模擬試卷模擬試卷習(xí)題集習(xí)題集PCR學(xué)科的進(jìn)展?？v觀形態(tài)爭論領(lǐng)域，50年月電子顯微鏡引入形態(tài)學(xué)觀看領(lǐng)域，帶來了從細(xì)胞水平到亞細(xì)胞水平的深入爭論0又將觀看的水平由亞細(xì)胞構(gòu)造推向了蛋白質(zhì)分子水平胞或亞細(xì)胞水平的定位，對醫(yī)學(xué)生物學(xué)的進(jìn)展無疑產(chǎn)生了深刻的影響。70年月，分子生物學(xué)技術(shù)在形態(tài)學(xué)中的廣泛應(yīng)用，隨著原位雜交技術(shù)的消滅，使組織細(xì)胞內(nèi)特定的DNA或?qū)W科的進(jìn)展?？v觀形態(tài)爭論領(lǐng)域，50年月電子顯微鏡引入形態(tài)學(xué)觀看領(lǐng)域，帶來了從細(xì)胞水平到亞細(xì)胞水平的深入爭論0又將觀看的水平由亞細(xì)胞構(gòu)造推向了蛋白質(zhì)分子水平胞或亞細(xì)胞水平的定位，對醫(yī)學(xué)生物學(xué)的進(jìn)展無疑產(chǎn)生了深刻的影響。70年月，分子生物學(xué)技術(shù)在形態(tài)學(xué)中的廣泛應(yīng)用，隨著原位雜交技術(shù)的消滅，使組織細(xì)胞內(nèi)特定的DNA或RNA序列能夠被定位，將蛋白質(zhì)水平又提高到基因水平即核酸分子的觀看和定位，從而使人類對很多生命現(xiàn)象在基因水平上的生疏得以深化；80年月，分子生物學(xué)領(lǐng)域中一項(xiàng)具有強(qiáng)大生命力的技術(shù)PCR使細(xì)胞內(nèi)低拷貝或單拷貝的特定DNA或RNA得以進(jìn)展定位及觀看。這一技術(shù)的問世，必將帶來更多的爭論成果，使形態(tài)學(xué)的爭論又向前邁出一大步。根本原理原位PCRPCR技術(shù)的高效擴(kuò)增與原位雜交的細(xì)胞定位結(jié)合起來，從而在組織細(xì)胞原位檢測單拷貝或低拷貝的特定的DNA或RNA序列。PCR技術(shù)是在DNA引物引導(dǎo)下的特異性靶序列快速地進(jìn)展擴(kuò)增，經(jīng)過擴(kuò)增的靶序列〔一般能擴(kuò)增106倍〕，很簡潔在凝膠電泳或Southern印記雜交中顯示出來，因此，PCR技術(shù)具有靈敏度高，特異性強(qiáng)的優(yōu)勢，隨著熱循環(huán)自動(dòng)化的提高與穩(wěn)定也使得PCR技術(shù)的操作簡便易行。但是，PCR技術(shù)是在液相中進(jìn)展的，在擴(kuò)增前，需將細(xì)胞破壞，從中提取核酸作為模板，因此很難將PCR的結(jié)果與組織細(xì)胞的形態(tài)構(gòu)造聯(lián)系起來，同時(shí)，也很難推斷含特異性靶序列的細(xì)胞類型。原位PCR技術(shù)成功地將PCR彌補(bǔ)了各自的缺乏。原位PCR技術(shù)的待檢標(biāo)本一般先經(jīng)化學(xué)固定，以保持組織細(xì)胞的良好形態(tài)構(gòu)造。細(xì)胞膜和核膜均具有確定的通透性，當(dāng)進(jìn)展PCR擴(kuò)增時(shí)，各種成分，如引物，DNA聚合酶，核苷酸等均可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)，以固定在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)的RNA或DNA為模板，于原位進(jìn)展擴(kuò)增。擴(kuò)增的產(chǎn)物一般分子較大，或相互交織，不易穿過細(xì)胞DNA或RNA根本類型依據(jù)在擴(kuò)增反響中所用的三磷酸核苷原料或引物是否標(biāo)記，原位PCR技術(shù)可分為直接法和間接法兩大類，此外，還有反轉(zhuǎn)錄原位PCR直接法原位PCR技術(shù)直接法原位PCR技術(shù)是將擴(kuò)增的產(chǎn)物直接攜帶標(biāo)記分子，即使用標(biāo)記的三磷酸腺苷或引物片斷。當(dāng)標(biāo)本進(jìn)展PCR擴(kuò)增時(shí)，標(biāo)記的分子就摻入到擴(kuò)增的產(chǎn)物中，顯示標(biāo)記物，就DNARNA〔原位〕中顯現(xiàn)出來。常用的標(biāo)記物有放射性同位素35S組織化學(xué)及免疫組織化學(xué)的方法去顯示標(biāo)記物所在位置。直接法原位PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便，流程短，省時(shí)。缺點(diǎn)是特異性較差，易消滅假陽性，擴(kuò)增效率也較低，特別是在石蠟切片上，上述缺點(diǎn)更為突出。由于在制片過程中，無論是固定，脫水還是包埋，都會(huì)導(dǎo)致DNA的損害，而受損的DNA可利用反響體系中的標(biāo)記三磷酸核苷進(jìn)展修復(fù)，這樣標(biāo)記物就會(huì)摻入到DNA的非靶序列中，造成假陽性。假設(shè)用PCR，其擴(kuò)增的效率比不標(biāo)記更低。間接法原位PCR技術(shù)間接法原位PCR技術(shù)師現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)展特定DNA或RNA原位雜交，明顯提高了特異性，是目前應(yīng)用最為廣泛的原位PCR間接法原位PCRPCR特定的DNA產(chǎn)物，因此，實(shí)際上是將PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)結(jié)合起來的一種技術(shù)，PCR(PCRinsituhybridization,PISH)。間接法PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是特異性較高，擴(kuò)增效率也較高。缺點(diǎn)是操作步驟較直接法繁瑣。原位反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)。PCR(insitureversetranscriptionPCR,InSituRT-PCR)是將液相的RT-PCR技術(shù)應(yīng)用到組織細(xì)胞標(biāo)本中的一種技術(shù)，與RT-PCR〔液相〕不同點(diǎn)在于，進(jìn)展原位反轉(zhuǎn)錄PCRDNADNAmRNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA，而不是細(xì)胞中原有的DNA。其它RT-PCR根本步驟原位PCR技術(shù)的根本步驟包括標(biāo)本的制備。原位擴(kuò)增〔PCR〕及原位檢測等根本環(huán)節(jié)，現(xiàn)分述如下〔重點(diǎn)以石蠟切片為例〕。標(biāo)本的制備原位PCR技術(shù)可應(yīng)用于細(xì)胞懸液、細(xì)胞涂片、冰凍切片以及石蠟切片。相比較而言，以懸浮的完整細(xì)胞做原位PCR效果最好，石蠟切片效果最差。隨著技術(shù)方面的一些問題被解決，近年也有從石蠟切片中得到滿足的PCR效率的報(bào)道。效果不好的緣由是多方面的，如：玻片上做PCR，熱傳導(dǎo)較差，熱對流不均勻，TaqDNA酶被玻璃片吸附等，更為主要的，假設(shè)能很好地解決石蠟切片原位PCR的有關(guān)技術(shù)問題，意義明顯是格外重大的。組織細(xì)胞的固定一般認(rèn)為組織細(xì)胞以10%的緩沖福爾馬林或4%的多聚甲醛固定后進(jìn)展原位PCR效果較好。固定的時(shí)間一般不宜過長，視組織的大小，一般以4℃4-6小時(shí)為宜。切片的厚度一般而言，切片假設(shè)厚一些，原位PCR的效果也較好一些，由于切片越厚，靶DNA的含量也就越多，同時(shí)膜構(gòu)造也較多，防止擴(kuò)增產(chǎn)物彌散的作用也越明顯。但厚切片細(xì)胞重疊多，形態(tài)學(xué)觀看的效果就差了，區(qū)分率也將下降。玻片的處理為防止石蠟切片在PCR和原位雜交過程中脫落，在玻片應(yīng)作防脫片處理，常用的方法是涂以多聚賴氨酸或用硅烷化處理，一般能防止組織脫落。蛋白酶的消化作用在進(jìn)展原位擴(kuò)增之前，組織標(biāo)本需經(jīng)蛋白酶處理。經(jīng)蛋白酶消化的序列，以利于擴(kuò)增。常用的蛋白酶有蛋白酶K，胰蛋白酶或胃蛋白酶。蛋白酶消化的程度就洗滌將酶完全去除，由于只要有少量的殘留酶存在，都將對隨后進(jìn)展的PCR反響體系的數(shù)TaqDNA蛋白酶消化處理組織細(xì)胞可提高通透性內(nèi)，但同時(shí)也使得擴(kuò)增產(chǎn)物的彌散時(shí)機(jī)增多，有可能帶來假陽性或假陰性的結(jié)果。原位擴(kuò)增〔PCR〕原位擴(kuò)增即在組織細(xì)胞標(biāo)本上進(jìn)展PCR反響，其根本原理與液相PCR完全一樣。引物PCR15-30bp為宜，擴(kuò)增的片斷為100-1000bp左右。原位RA很少超過A很少超過，較長序列的擴(kuò)增易引起引物與模板的錯(cuò)配而導(dǎo)致非特異性反響的消滅。反響體系原位PCR的反響體系與常規(guī)的液相PCR根本一樣，由于是在經(jīng)過固定的組織切片上進(jìn)展，為獲得較好的擴(kuò)增效果，有人主見反響體系中的引物，TaqDNA聚合酶以及R〔,TaqDNA熱循環(huán)原位PCRPCR充填，將載玻片至于平臺(tái)上，即可進(jìn)展熱循環(huán)的步驟。為了保證進(jìn)展充分的擴(kuò)增，原位PCR熱循環(huán)中每一步驟的時(shí)間可比常規(guī)PCR略長些，〔hotstart〕80-94TaqDNA聚合酶。為了保證反響體系在熱循環(huán)過程不過多喪失，可用清亮的指甲油，礦物油或PAP筆把蓋片四周封閉起來。洗滌原位擴(kuò)增完畢后，標(biāo)本應(yīng)清洗，以除去彌散到細(xì)胞外的擴(kuò)增產(chǎn)物。洗滌不充分，造成細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增的產(chǎn)物被洗脫，是陽性信號(hào)減弱或喪失。有作者在擴(kuò)增后用4%多聚甲醛2小時(shí)或2%戊二醛5分鐘進(jìn)展后固定，以使擴(kuò)增的產(chǎn)物在檢測時(shí)能很好地保存在細(xì)胞內(nèi)，提高檢測的敏感性和特異性。原位檢測原位PCRPCR的性質(zhì)對擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)展原位檢測。間接法則需用原位雜交的方法進(jìn)展檢測。和組織化學(xué)技術(shù)一樣，詳見前述。原位雜交的根本步驟詳見核酸雜交一章。原位PCR技術(shù)的應(yīng)用原位PCRPCR的應(yīng)用分為檢測外源性基因和內(nèi)源性基因兩方面。1、用于外源性基因的檢測病毒基因的檢測感染病毒的細(xì)胞常無較好的檢測手段，但當(dāng)原位PCR技術(shù)應(yīng)用后，使這一極為困難的問題有望解決。對HIV、HPV、HSV、HBV、HCV等多種病毒的檢測，使我們能夠成功等觀看到這些病毒在艾滋病、生殖系統(tǒng)腫瘤、肝炎及肝癌中的作用，能夠準(zhǔn)時(shí)覺察受感染的人群。細(xì)菌基因的檢測最突出的應(yīng)用是在結(jié)核桿菌的檢測上〔詳見第一篇第五章〕很難在鏡下找到結(jié)核桿菌，而應(yīng)用原位PCR技術(shù)可幫助明確診斷，當(dāng)結(jié)核桿菌很少時(shí)仍能在鏡下被很簡潔地找出來。導(dǎo)入基因的檢測模擬試卷PCRPCR技術(shù)成為重要的檢測手段。2、用于內(nèi)源性基因的檢測特別基因的檢測機(jī)體內(nèi)基因的突變、重排、也可用原位PCR技術(shù)進(jìn)展檢測，原癌基因，抑癌基因的突前景。固有基因的檢測對于機(jī)體細(xì)胞內(nèi)只有單個(gè)或幾個(gè)拷貝的低表達(dá)固有基因少而無能為力，液相PCR雖可進(jìn)展擴(kuò)增檢測出來，但不能確定含有該基因的細(xì)胞類型，原位PCR技術(shù)則彌補(bǔ)了上述兩種技術(shù)的缺乏，使得我們能夠?qū)θ祟惛鞣N基因進(jìn)展檢測，而完成人類基因圖的繪制。熒光原位雜交熒光原位雜交方法是一種物理圖譜繪制方法，使用熒光素標(biāo)記探針，以檢測探針和分裂中期的染色體或分裂間期的染色質(zhì)的雜交。熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH20世紀(jì)80年月末在放射性原位雜交技術(shù)的根底上進(jìn)展起來的一種非放射性分子細(xì)胞遺傳技術(shù),以熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記而形成的一種的原位雜交方法,探針首先與某種介導(dǎo)分子(reporter習(xí)題集模擬試卷模擬試卷習(xí)題集習(xí)題集molecule)結(jié)合,雜交后再通過免疫細(xì)胞化學(xué)過程連接上熒光染料[1,2].FISH的根本原理是將DNA(或RNA)探針用特別的核苷酸分子標(biāo)記,然后將探針直接雜交到染色體或DNA纖維切片上,再用與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體與探針分子特異性結(jié)合來檢測DNA序列在染色體或DNA纖維切片上的定性、定位、相對定量分析.FISH具有安全、快速、靈敏度高、探針能長期保存、能同時(shí)顯示多種顏色等優(yōu)點(diǎn),不但能顯示中期分裂相,還能顯示于間期核.同時(shí)在熒光原位雜交根底上又進(jìn)展了多彩色熒光原位雜交技術(shù)和染色質(zhì)纖維熒光原位雜交技術(shù).對于利用rRNA的熒光原位雜交來說，如下緣由可導(dǎo)致較低的熒光信號(hào)強(qiáng)度：較低的細(xì)胞核糖體含量較低的細(xì)胞周邊的通透性較低的目標(biāo)序列可接觸性〔由于rRNA的折疊產(chǎn)生的構(gòu)象，有些位置與rRNA分rRNA〕隆熒光原位雜交”(clone-FISH)進(jìn)展試驗(yàn)：將rRNA基因結(jié)合入質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中表達(dá)，構(gòu)成核糖體，再用熒光標(biāo)記的探針雜交。FISH可與流式細(xì)胞術(shù)聯(lián)用，對特定熒光標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)展計(jì)數(shù)或者分別。熒光原位雜交〔FISH〕技術(shù)簡介1974年Evans準(zhǔn)確性。20世紀(jì)70年月后期人們開頭探討熒光標(biāo)記的原位雜交，即FISH技術(shù)。1981年Harper成功地將單拷貝的DNA序列定位到G顯帶標(biāo)本上，標(biāo)志著染色體定位技術(shù)取得了重要進(jìn)展。20世紀(jì)90年月，隨著人類基因組打算的進(jìn)展，由于繪制高區(qū)分人類基因組圖譜的需要，F(xiàn)ISH原理FISH(fluorescenceinsituhybridization)技術(shù)是一種重要的非放射性原位雜交技DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補(bǔ)的，二者經(jīng)變性-退火-復(fù)性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。將核酸探DNA進(jìn)展定性、定量或相對定位分析。試驗(yàn)流程FISH樣本的制備→探針的制備→探針標(biāo)記→雜交→〔染色體顯帶〕→熒光顯微鏡檢測→結(jié)果分析。特點(diǎn)原位雜交的探針按標(biāo)記分子類型分為放射性標(biāo)記和非放射性標(biāo)記較繁瑣等。承受熒光標(biāo)記系統(tǒng)則可抑制這些缺乏，這就是FISH技術(shù)。FISH技術(shù)作為非放射性檢測體系，具有以下優(yōu)點(diǎn):1、熒光試劑和探針經(jīng)濟(jì)、安全；2、探針穩(wěn)定，一次標(biāo)記后可在兩年內(nèi)使用；3、試驗(yàn)周期短、能快速得到結(jié)果、特異性好、定位準(zhǔn)確；4、FISH可定位長度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當(dāng)；5、多色FISH通過在同一個(gè)核中顯示不同的顏色可同時(shí)檢測多種序列；6、既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或構(gòu)造的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA缺點(diǎn)：不能到達(dá)100%雜交，特別是在應(yīng)用較短的cDNA探針時(shí)效率明顯下降。4．應(yīng)用該技術(shù)不但可用于基因或序列的染色體定位標(biāo)記及染色體畸變的爭論。在基因定性、定量、整合、表達(dá)等方面的爭論中頗具優(yōu)勢。熒光原位雜交技術(shù)的進(jìn)展歷程FISH技術(shù)檢測位點(diǎn)數(shù)目及檢測目標(biāo)的進(jìn)展在FISH技術(shù)根本確立之后，F(xiàn)ISH不僅用于單基因或核酸檢測，F(xiàn)ISH技術(shù)的進(jìn)一步進(jìn)展擴(kuò)展到多色FISH胞中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNAs原位檢測以及組織水平的核酸檢測，并且在今后的爭論中還有可能和隨機(jī)引物DNA合成法來制備以獲得特異性雜交克隆細(xì)胞遺傳學(xué)上FISH交〔Comparativegenomichybridization〕用于檢測染色體區(qū)域的缺失和重復(fù)。大片段探片段＜200核苷酸?，F(xiàn)在檢測手段的提高以及檢測軟件的不斷進(jìn)展使得FISH技術(shù)的檢測要探針高區(qū)分技術(shù)。隨著檢測目標(biāo)越來越小，F(xiàn)ISH技術(shù)已用于隱蔽的亞端粒核型基因重排和mRNAFISH檢測范圍的擴(kuò)大，使得FISH技術(shù)的應(yīng)用在2090年月急速增長。由FISH轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別由一種可以區(qū)分的熒光信號(hào)來表示了FISH12個(gè)。承受計(jì)算機(jī)翻譯的五色方案可同時(shí)檢測出人類全部染色體代表著FISH技術(shù)多位點(diǎn)檢測的里程碑。盡管可以承受多種方法觀測到mRNAs，但是FISH對整個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的原位分析似乎更有應(yīng)用前景。顏色譯碼技術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了對整個(gè)組織的檢測。FISH技術(shù)的定量分析階段Pinkel 等〔1986〕首次將熒光圖像定量分析用于根本細(xì)胞遺傳檢測，承受雙色激發(fā)塊裝置照相機(jī)檢測熒光信號(hào)，而且定量分析技術(shù)很快用于了 mRNA檢測。熒光檢測的關(guān)鍵是信號(hào)的重現(xiàn)性、無規(guī)律性及背景的自發(fā)熒光。不僅不同的樣品之間熒光不同，而且同一載玻片上的材料或者同樣的細(xì)胞都有可能顯示出不均衡的熒光。目前已有多種方法用于消退一些組織中的自發(fā)熒光：如樣品制備過程中，承受的消退自發(fā)熒光試劑包括硼氫化鈉或者承受光照輻射進(jìn)展預(yù)處理以消退非特異性背景信號(hào)。這些消退自發(fā)熒光的方法并不完全有效， 通常在進(jìn)展圖像分析時(shí)通過計(jì)算機(jī)算術(shù)除去自發(fā)熒光信號(hào)。熒光圖像的光譜數(shù)據(jù)包括真正的信號(hào)和很多雜噪，分別進(jìn)展分析并且通過單獨(dú)的光譜組分分析除掉雜噪數(shù)據(jù)。多色 FISH有自身的限制，包括不同的熒光強(qiáng)度和顏色重疊。但是通過計(jì)算機(jī)算法分析平衡了多色圖像，包括強(qiáng)度變化和自動(dòng)糾正信號(hào)重疊。FISH圖像自身的限制并沒有影響到自動(dòng)破譯算法的進(jìn)展。承受序列較大探針進(jìn)展DNA位點(diǎn)檢測和多色熒光計(jì)數(shù)算法關(guān)心病理學(xué)家實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化分析。此外，檢測探針試劑盒和點(diǎn)計(jì)數(shù)方法的應(yīng)用為便捷的檢測結(jié)果供給了一個(gè)平臺(tái)。 盡管多種方法已經(jīng)用于分析或優(yōu)化自動(dòng)細(xì)胞檢測系統(tǒng)， 人工的細(xì)胞病理檢測仍是可信度高的組織分析方法。然而，細(xì)胞制備、鑒別、固定介質(zhì)上細(xì)胞樣品計(jì)算機(jī)化檢測在將來的醫(yī)學(xué)診斷中的高效益性不容無視，快速檢測細(xì)胞內(nèi)的分子信號(hào)只有通過計(jì)算機(jī)關(guān)心方法進(jìn)展檢中的高效益性不容無視，快速檢測細(xì)胞內(nèi)的分子信號(hào)只有通過計(jì)算機(jī)關(guān)心方法進(jìn)展檢測。現(xiàn)在，自動(dòng)化檢測程序已經(jīng)擴(kuò)展到承受多基因轉(zhuǎn)錄模型檢測特異的DNA簇和轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)以確定功能細(xì)胞的狀態(tài)。FISH 技術(shù)檢測領(lǐng)域的進(jìn)展鑒于FISH起始階段的進(jìn)展主要是探針類型和檢測位點(diǎn)的擴(kuò)展， 熒光檢測技術(shù)將來的進(jìn)展可能包括檢測領(lǐng)域的擴(kuò)展。 熒光圖像臨床診斷應(yīng)用需要在檢測體系上進(jìn)一步提高，如探針的結(jié)合，照相和分析的自動(dòng)化，因此避開了不同操作間的誤差。樣品厚度是熒光顯微鏡檢測樣品類型的一個(gè)限制因素。 近來的激光共聚焦顯微鏡和光學(xué) X射線斷層攝影技術(shù)要求樣品厚度到達(dá) 1~2mm。一種改進(jìn)的光學(xué)投射 X顯微斷層攝影技術(shù)可以獵取到 15mm厚樣品的圖像擴(kuò)大了生物學(xué)和診