哮喘大鼠肺與大腸組織表面蛋白amrna表達(dá)改變及針刺調(diào)節(jié)的初步研究

哮喘大鼠肺與大腸組織表面蛋白amrna表達(dá)改變及針刺調(diào)節(jié)的初步研究

肺與結(jié)腸的內(nèi)外結(jié)合是中醫(yī)腸道內(nèi)外理論的組成部分之一。肺與大腸在生理上相互聯(lián)系,病理上相互影響。有資料表明,二者的密切聯(lián)系具有生物醫(yī)學(xué)依據(jù)。以往認(rèn)為肺表面活性蛋白(surfactantprotein,SP)只在肺內(nèi)存在,且有A、B、C、D4種亞型,其中以SP-A含量最為豐富,是降低肺泡表面張力,維持肺泡穩(wěn)定和正常的呼吸功能的重要物質(zhì)。近來發(fā)現(xiàn),在結(jié)腸和小腸表面也有SP-A基因存在和蛋白表達(dá),表明腸道表面和肺表面存在密切聯(lián)系。本實驗從針灸治療哮喘為切入點(diǎn),觀察了哮喘大鼠肺與大腸SP-AmRNA表達(dá)改變及針刺對其的調(diào)節(jié),為臟腑相關(guān)的物質(zhì)基礎(chǔ)研究和針灸效應(yīng)研究提供依據(jù)。1材料和動物1.1動物質(zhì)量合格雄性Sprague-Dawley大鼠,清潔級,體質(zhì)量(130±30)g,由吉林大學(xué)實驗動物中心提供,動物質(zhì)量合格證號為20080020。1.2儀器和檢測設(shè)備卵蛋白,OVA,美國Sigma公司進(jìn)口分裝,批號20080321;氫氧化鋁,長春新華宇生物科技有限公司,批號20080626;戊巴比妥鈉,美國Sigma公司進(jìn)口分裝,批號200901111;TRIzol,美國Invitrogen公司產(chǎn)品;氯仿,北京市化工廠產(chǎn)品,批號20090121;DEPC原液,Sigma公司進(jìn)口分裝;瓊脂糖,西班牙Biowest公司產(chǎn)品;RT-PCR一步法試劑盒,美國Promega公司產(chǎn)品;DNAMarker,北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品;引物序列,寶生物工程大連有限公司產(chǎn)品。SMUP-B型生物信號處理系統(tǒng),上海嘉龍教學(xué)儀器廠產(chǎn)品;呼吸流量測定系統(tǒng),美國KentScientificCorporation產(chǎn)品;呼吸流量實驗測量軟件,復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理教研室提供;AllegraX-22R低溫高速離心機(jī),德國BeckmanCoulter公司產(chǎn)品;5418小型高速離心機(jī),Eppendorf公司產(chǎn)品;TC-512PCR擴(kuò)增儀,英國Techne公司產(chǎn)品;Cintra202型紫外分光光度計,澳大利亞GBC公司產(chǎn)品;DYY-12C型水平電泳系統(tǒng),北京六一儀器廠產(chǎn)品;PowerPacHV電泳儀,美國Bio-Rad公司產(chǎn)品;TANNON-2010數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)及GIS凝膠圖像分析軟件,上海天能科技有限公司產(chǎn)品;Milli-DI超純水系統(tǒng),美國Millipore公司產(chǎn)品。1.3含卵蛋白的單次注射將48只SD大鼠隨機(jī)分成空白對照組、捆綁組、假手術(shù)組、哮喘模型組、原絡(luò)配穴組(太淵、偏歷)、原穴組(太淵)6組。哮喘模型組的處理參照文獻(xiàn)方法:將SD大鼠在實驗第1天一次性向腹腔注射含卵蛋白0.250g和氫氧化鋁凝膠0.250g的生理鹽水1.5mL以致敏,第15天將大鼠用5g/L戊巴比妥鈉麻醉后固定于手術(shù)臺上,行氣管插管術(shù),并于頸外靜脈內(nèi)注射卵蛋白(0.250g/kg體質(zhì)量)激發(fā)哮喘發(fā)作。原絡(luò)配穴組大鼠、原穴組大鼠第1天致敏,腹腔注射后1h進(jìn)行針刺治療,于實驗第15天激發(fā)哮喘發(fā)作,方法同上。假手術(shù)組大鼠于第1天腹腔注射1.5mL生理鹽水,第15天以等量生理鹽水(1μL/g)行頸外靜脈注射,方法同上。空白對照組大鼠不做任何處理,正常飼養(yǎng)。1.4穴位選取方法穴位定位據(jù)《實驗針灸學(xué)》確定。針刺方法:平補(bǔ)平瀉,每次留針20min,每隔5min行針1次,隔日針刺1次,共針7次。原絡(luò)配穴組自實驗第1天開始進(jìn)行針刺治療,穴位選取太淵(雙)、偏歷(雙);原穴組穴位選取太淵(雙);捆綁組自實驗第1天起開始捆綁,不針刺,每次20min,隔日綁1次,共捆綁7次。1.5指標(biāo)和方法的檢測1.5.1總rna的提取及國家機(jī)關(guān)檢測大鼠放血處死后,迅速在冰盤上切取肺、大腸組織。組織選取部位:肺組織——取左肺下葉肺尖(1cm×1cm);大腸組織——自闌門向大腸方向2.5cm處取1cm腸段。組織切取后用錫紙包好,迅速做好標(biāo)記放入液氮中冷凍,使液氮滲透到組織內(nèi)部而防止組織內(nèi)部發(fā)生RNA降解,后移至-80℃超低溫冰箱中保存。用TRIzol法抽提組織中的總RNA,所得總RNA經(jīng)紫外分管光度計檢測純度及濃度。用紫外分光光度計檢測波長260nm和280nm的吸光度值,D260/D280的比值在1.8～2.0之間的予以保留,其余棄去不用?？俁NA原液稀釋一定比例,使樣品總RNA溶液的D260值在0.1～0.4之間,放入通光池中檢測,利用公式計算總RNA的濃度。根據(jù)所測RNA濃度調(diào)整PCR體系中總RNA的體積,使各體系所含的RNA量相同。1.5.2rt-pcr基因擴(kuò)增引物序列設(shè)計按照參考文獻(xiàn),引物序列由寶生物工程(大連)公司合成。SP-A:5’-GGAAGCCCTGGGATCCCTGGA-3’(上游),5’-TGGGTACCAGTTGGTGTAGT-3’(下游);GAPDH:5’-CCATGGAGAAGGCTGGGG3’(上游),5’-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3’(下游)。以SP-A為目的基因,以GAPDH為內(nèi)參,在同一體系內(nèi)做RT-PCR基因擴(kuò)增,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,將同一泳道內(nèi)的SP-A與GAPDH兩條基因表達(dá)條帶的相對密度比作為SP-AmRNA表達(dá)水平的反映。一步法RT-PCR反應(yīng)程序:45℃逆轉(zhuǎn)錄45min,94℃預(yù)變性2min,94℃變性30s,60℃退火1min,延伸68℃2min,循環(huán)40次,68℃延伸7min,最后降至4℃結(jié)束反應(yīng)?；驍U(kuò)增結(jié)束后,取3mLRT-PCR產(chǎn)物在經(jīng)EB染色的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳,電壓60V,時間為100min。各組RNA樣品按一步法程序經(jīng)RT-PCR基因擴(kuò)增后,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)束將凝膠移至GIS數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)中拍照。1.6單因素方差分析采用SPSS11.0統(tǒng)計分析軟件處理。計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)(xˉ)±(xˉ)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示,多組間比較和組間兩兩比較用單因素方差分析。以P<0.05為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。2原穴和原穴對大鼠肺sp-amrna表達(dá)的影響肺和大腸組織中均有SP-AmRNA表達(dá)。各組中肺和大腸SP-AmRNA的表達(dá)水平由SP-A和GAPDH2條條帶的相對密度比代表。見圖1及表1,2。圖1可見,肺和大腸組織中均擴(kuò)增出目的基因SP-A和內(nèi)參GAPDH基因,且各組間SP-A基因的表達(dá)豐度存在差異。由表1可知,哮喘模型組大鼠肺組織SP-AmRNA表達(dá)水平與假手術(shù)組對比明顯降低,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);捆綁組、假手術(shù)組與空白對照組對比,肺組織SP-AmRNA的表達(dá)水平升高,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),提示捆綁束縛刺激、手術(shù)傷害性損傷等因素對大鼠肺SP-AmRNA表達(dá)有顯著影響;原絡(luò)配穴組和原穴組大鼠肺組織SP-AmRN表達(dá)水平與哮喘模型組對比明顯升高,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,P<0.05),且原絡(luò)配穴組大鼠肺組織SP-AmRNA表達(dá)水平高于原穴組,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示針刺能夠明顯升高哮喘大鼠肺組織中SP-AmRNA表達(dá)水平,原絡(luò)配穴法效果優(yōu)于單純原穴法治療。由表2可知,捆綁組、假手術(shù)組大腸組織SP-AmRNA表達(dá)水平與空白對照組對比,假手術(shù)組與捆綁組對比,差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),提示手術(shù)傷害性損傷對大鼠大腸SP-AmRNA表達(dá)有明顯影響,手術(shù)傷害性損傷與捆綁是2種不同性質(zhì)的刺激;原絡(luò)配穴組、原穴組大鼠大腸組織SP-AmRNA表達(dá)水平與哮喘模型組對比,差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而此2組間差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但以原絡(luò)配穴組升高幅度較大,提示針刺治療能夠顯著升高哮喘大鼠大腸組織SP-AmRNA的表達(dá)水平,且以原絡(luò)配穴法效果較優(yōu)。3sp-a在肺與臟器疾病的作用整體觀念是中醫(yī)學(xué)的基本特征之一,臟腑相關(guān)是其理論核心,認(rèn)為人體內(nèi)部的組織器官是相互聯(lián)系的統(tǒng)一整體,并在中醫(yī)臨床實踐中發(fā)揮著至關(guān)重要的指導(dǎo)作用。中醫(yī)學(xué)關(guān)于肺和大腸關(guān)系的認(rèn)識源于《黃帝內(nèi)經(jīng)》,《靈樞·本輸》篇稱這種關(guān)系為“肺合大腸”,《素問·血?dú)庑沃尽菲Q之為“陽明與太陰為表里”。肺與大腸通過經(jīng)絡(luò)相聯(lián)系,構(gòu)成臟腑陰陽表里的絡(luò)屬關(guān)系,構(gòu)成肺與大腸在生理、病理、治療上的相互關(guān)系。肺與大腸的上述有機(jī)聯(lián)系,是中醫(yī)學(xué)以藏象學(xué)說為核心的整體觀念的一種體現(xiàn)。SP-A是肺表面活性物質(zhì)的重要蛋白成分,在肺泡中的功能是促進(jìn)PS在氣液界面的吸附和擴(kuò)展,協(xié)助表面活性物質(zhì)磷脂降低表面張力,調(diào)節(jié)磷脂的合成、分泌和再循環(huán)。SP-A能夠維持PS正常的結(jié)構(gòu)和代謝,表現(xiàn)為SP-A作為自身調(diào)節(jié)因子可穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)外的表面活性物質(zhì)水平。因此,SP-A在肺中的作用之一是保證PS發(fā)揮其正常的生理功能,維持正常的呼吸運(yùn)動。PS量的減少和SP-A、SP-B等的基因改變與呼吸系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。有學(xué)者測定了哮喘患者與正常人肺泡灌洗液中SP-A蛋白的含量,發(fā)現(xiàn)哮喘患者肺泡灌洗液中SP-A含量明顯下降(P<0.05),而磷脂酰膽堿含量基本一致。SP-A有調(diào)節(jié)炎性及過敏反應(yīng)的作用,在肺的免疫系統(tǒng)防御功能中有重要作用。以往認(rèn)為,SP-A只在肺內(nèi)存在,且含量最為豐富,是降低肺泡表面張力、維持肺泡穩(wěn)定和正常的呼吸功能的重要物質(zhì)。近來發(fā)現(xiàn),在結(jié)腸和小腸表面也發(fā)現(xiàn)有SP-A基因和蛋白表達(dá)存在,表明腸道表面和肺表面存在密切聯(lián)系。本次研究結(jié)果也顯示,哮喘模型組大鼠肺及大腸組織中SP-AmRNA的表達(dá)水平低于假手術(shù)組大鼠,而針刺相應(yīng)腧穴又可使肺和大腸組織中SP-AmRNA表達(dá)顯著增加,提示SP-A基因和蛋白表達(dá)可能是肺和大腸相關(guān)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)和途徑。有資料表明,結(jié)腸和肺中SP-A基因序列完全相同,且這兩種器官中編碼SP-A的基因轉(zhuǎn)錄子起始于相同的位點(diǎn),此為本實驗結(jié)果提供了依據(jù)。本實驗中,哮喘發(fā)作時SP-AmRNA表達(dá)減少,針刺后SP-A