蒿甲醚體外抗多房棘球絳蟲(chóng)原頭作用研究

蒿甲醚體外抗多房棘球絳蟲(chóng)原頭作用研究

cyheecec癥是一種嚴(yán)重的人畜共病，由人類和某些動(dòng)物寄生蟲(chóng)引起，并分布在世界各地。引起人體包蟲(chóng)病的棘球絳蟲(chóng)主要有2種,即細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)(Echinococcusgranulosus,Eg)和多房棘球絳蟲(chóng)(Echinococcusmultilocularis,Em)。多房棘球絳蟲(chóng)幼蟲(chóng)引起的泡型棘球蚴病(alveolarechinococcosis)簡(jiǎn)稱泡球蚴病,主要分布于北半球,流行地區(qū)遍及北美洲的大部分區(qū)域和歐洲、亞洲北部。在我國(guó),泡球蚴病主要分布于寧夏,甘肅的漳縣和靖遠(yuǎn)縣,西藏、青海南部高原,四川西部甘孜地區(qū),新疆北部和內(nèi)蒙東部呼倫貝爾草原一帶。泡球蚴在中間宿主肝內(nèi)以出芽的方式生長(zhǎng)或浸潤(rùn)式增殖,產(chǎn)生新囊泡,長(zhǎng)入肝組織,囊壁外角皮層很薄且常不完整,囊體與周圍組織間無(wú)明顯界限,囊液持續(xù)滲漏,可引起局部肝組織病變、變性、肝纖維化、萎縮、增生和壞死,晚期似肝癌一樣轉(zhuǎn)移或侵害周圍臟器,臨床有“蟲(chóng)癌”之稱。該病潛伏期長(zhǎng),早期很難發(fā)現(xiàn),而中晚期病例手術(shù)治療難以取得滿意效果,預(yù)后極差。本研究采用體外培養(yǎng)方法觀察了蒿甲醚抗多房棘球絳蟲(chóng)原頭蚴的作用。材料和方法1體外培養(yǎng)in從昆明鼠泡球蚴病模型中無(wú)菌操作取出小鼠腹腔繼發(fā)性泡球蚴組織并剪碎,用含青霉素和鏈霉素各500U/ml的無(wú)菌0.9%生理鹽水稀釋,自然沉淀約30min后棄去上液,沉淀物用含雙抗的生理鹽水再清洗3次,最后用含雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液清洗,收集原頭節(jié),光鏡下檢查原頭蚴存活率占95%以上,即用于體外培養(yǎng)。蒿甲醚(artemether),購(gòu)于廣州斯威森科技有限公司(批號(hào):SWX20100401,純度為99.35%);阿苯達(dá)唑,購(gòu)于寧夏啟元國(guó)藥有限公司(產(chǎn)品批號(hào):090409);DMEM極限必需培養(yǎng)液,為含15%胎牛血清及青霉素和鏈霉素各500U/ml的RPMI-1640。2小組回復(fù)突變?cè)囼?yàn)lsk及阿苯達(dá)唑波球超微結(jié)構(gòu)測(cè)定分別將蒿甲醚和阿苯達(dá)唑用DMSO配制成2mg/ml溶液。共設(shè)4個(gè)組(每組約3000個(gè)原頭節(jié)),即蒿甲醚高劑量組(100μg/ml)、蒿甲醚低劑量組(50μg/ml)、阿苯達(dá)唑組(50μg/ml)和空白對(duì)照組。每組設(shè)2個(gè)平行組。在每組培養(yǎng)瓶中加入DMEM培養(yǎng)液8ml,同時(shí)加入原頭蚴約2ml。在蒿甲醚低劑量組和高劑量組分別加入2mg/ml蒿甲醚250μl和500μl,使藥物終濃度分別為50μg/ml和100μg/ml;阿苯達(dá)唑組加入2mg/ml阿苯達(dá)唑250μl,使藥物終濃度為50μg/ml?？瞻捉M不加藥物。經(jīng)混勻后置37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。每天觀察1次,方法為每組各取培養(yǎng)液2～3滴于干凈玻片上,用0.03%美藍(lán)染色4～5min,顯微鏡下觀察,如原頭蚴蟲(chóng)體1/2以上被染成藍(lán)色則為死亡。每天每次每組計(jì)數(shù)原頭蚴約200個(gè),計(jì)算原頭蚴死亡率。同時(shí)取蒿甲醚低劑量組、蒿甲醚高劑量組、阿苯達(dá)唑治療組及對(duì)照組泡球蚴培養(yǎng)物,用4%戊二醛前固定,四氧化娥后固定,丙酮梯度脫水,EPDN2812包埋,LKB2Nova型超薄切片機(jī)切片,醋酸鉛、檸檬酸鋁雙重染色后,在JEM1230(Jeol,Japan)下觀察泡球蚴超微結(jié)構(gòu)。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,采用χ2檢驗(yàn),α=0.05,兩兩比較檢驗(yàn)水準(zhǔn)經(jīng)bonferroni法調(diào)整。結(jié)果1藥物作用后原頭死亡率的變化光鏡下觀察,空白對(duì)照組原頭蚴頂突小鉤脫落不明顯,吸盤著色與其他部位相同(圖1);各藥物組死亡的原頭蚴被濃度為0.03%的美藍(lán)染成藍(lán)色,其中蒿甲醚高劑量組原頭蚴吸盤著色較深(圖2)。掃描電鏡觀察空白對(duì)照組原頭蚴小鉤排列整齊,吸盤結(jié)構(gòu)完整,微毛清晰可見(jiàn)(圖3);蒿甲醚高劑量組原頭蚴頂突外翻,小鉤脫落,微毛紊亂甚至消失(圖4)。藥物作用后的原頭蚴死亡率見(jiàn)表1。每天各藥物組原頭蚴死亡率與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而蒿甲醚低劑量組(50μg/ml)組原頭蚴死亡率與高劑量組(100μg/ml)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),且呈劑量、時(shí)間依賴。培養(yǎng)至第9d時(shí),蒿甲醚高劑量組(100μg/ml)原頭蚴死亡率為100%。蒿甲醚低劑量組原頭蚴死亡率93.28%,阿苯達(dá)唑組原頭蚴死亡率99.03%,空白對(duì)照組原頭蚴死亡率78.83%(表1)。(本文圖見(jiàn)封二)青蒿素及其衍生物的體外抗多房木現(xiàn)有病毒原頭和安全性觀察蒿甲醚是青蒿素的衍生物之一。青蒿素是從菊科艾屬(Artemisiaannua)莖葉提取的含過(guò)氧基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯,可生成雙氫青蒿素、蒿甲醚和青蒿琥酯等多種衍生物,均是治療瘧疾的有效單體。隨著抗瘧機(jī)制的深入研究,其抗腫瘤作用備受關(guān)注。一些學(xué)者在青蒿素對(duì)白血病等癌細(xì)胞增殖抑制方面進(jìn)行了初步探索。隨著對(duì)青蒿素類藥物藥理作用研究的不斷深入,證實(shí)其具有抗瘧、抗孕、抗纖維化、抗血吸蟲(chóng)、抗弓形蟲(chóng)、抗心律失常和腫瘤細(xì)胞毒性等作用。由于目前對(duì)于包蟲(chóng)病的發(fā)生機(jī)理尚不明確,而治療中常出現(xiàn)抗阿苯達(dá)唑等經(jīng)典藥物的病例,因此尋找新的有效治療藥物意義重大。鑒于青蒿素及其衍生物對(duì)各種疾病中的良好治療作用,本研究選擇其衍生物蒿甲醚進(jìn)行體外抗多房棘球絳蟲(chóng)原頭蚴作用觀察,結(jié)果顯示50μg/ml和100μg/ml組原頭蚴死亡率與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),抗蟲(chóng)效果與阿苯達(dá)唑相當(dāng)。另外觀察到,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),原頭蚴的死亡率增高,蒿甲醚低劑量組(50μg/ml)原頭蚴死亡率與高劑量組(100μg/ml)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(>.)。表明蒿甲醚抗原頭蚴作用呈時(shí)間、劑量依賴。但在培養(yǎng)至第9d時(shí),蒿甲醚高劑量組(100μg/ml)原頭蚴死亡率達(dá)100%,抗原頭蚴作用顯著。本實(shí)驗(yàn)初步觀