氫溴酸高烏甲素在大鼠胃腸道的吸收動(dòng)力學(xué)研究

氫溴酸高烏甲素在大鼠胃腸道的吸收動(dòng)力學(xué)研究

氨基高吳甲素（也稱為黃酮堿，谷氨酸lh）是毛護(hù)科高吳甲素植物的高刺激性生物。它是國(guó)內(nèi)首創(chuàng)的非成毒性鎮(zhèn)痛藥物，用于治療上述疼痛。本品具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用,與哌替啶相比鎮(zhèn)痛效果相當(dāng),起效時(shí)間稍慢,而維持時(shí)間較長(zhǎng);鎮(zhèn)痛作用為解熱鎮(zhèn)痛藥氨基比林的7倍。毒理學(xué)本品動(dòng)物實(shí)驗(yàn)無致畸胎作用。氫溴酸高烏甲素具有顯著的抗炎消腫、降溫解熱與局部麻醉作用。臨床上高烏甲素主要用于癌癥疼痛的治療以及術(shù)后鎮(zhèn)痛。本研究組在氫溴酸高烏甲素口服片劑的藥動(dòng)學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)該藥口服給藥生物利用度較低,因此研究該藥在胃腸道各段的吸收部位特異性以及機(jī)理對(duì)于設(shè)計(jì)口服制劑以提高其生物利用度具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠在體腸灌流的試驗(yàn)方法,考察氫溴酸高烏甲素在胃、小腸、結(jié)腸的吸收,了解該藥在胃腸道的吸收特征,并考察了不同吸收促進(jìn)劑對(duì)其吸收的促進(jìn)效果及毒性,此外,還考察了P-糖蛋白抑制劑對(duì)藥物小腸吸收的影響,為提高其口服生物利用度和開發(fā)口服制劑提供生物藥劑學(xué)依據(jù)。材料表面1試劑及試劑用量氫溴酸高烏甲素(蘭州制藥廠產(chǎn)品,批號(hào):20060602,HPLC純度為97.2%);鹽酸維拉帕米(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)。烏拉坦(上海中秦化學(xué)試劑有限公司);甲醇(色譜純,山東禹王實(shí)業(yè)有限公司);十二烷基硫酸鈉(進(jìn)口分裝);去氧膽酸鈉(上海中秦化學(xué)試劑有限公司);癸酸鈉(進(jìn)口分裝);水為純凈水,其他試劑均為分析純。Krebs-Ringer試劑(pH7.4,簡(jiǎn)稱K-R試液)的配制:稱取氯化鈉7.8g,氯化鉀0.35g,氯化鈣0.37g,碳酸氫鈉1.37g,磷酸二氫鈉0.32g,氯化鎂0.02g,葡萄糖1.4g,加純水定容至1000mL,即得。人工胃液:按《中華人民共和國(guó)藥典》2005年版二部附錄配制。2長(zhǎng)紫外過濾器Shimadzu高效液相色譜儀(包括SCL10Atvp系統(tǒng)控制器,SPDM10Avp可調(diào)波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器,LC10Atvp輸液泵,DGU12A脫氣機(jī),725I型手動(dòng)進(jìn)樣閥,CTO10ASvp柱溫箱,日本島津公司);全自動(dòng)電子分析天平(北京賽多利斯儀器系列有限公司);DDBT320型電子蠕動(dòng)泵(上海之信儀器有限公司);UV1700紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)。3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性SD大鼠,體重300g左右,購(gòu)自蘭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,許可證號(hào):SCXK(甘)20050007。方法1試驗(yàn)溶液中氫溴酸高烏甲基素濃度的測(cè)定1.1高烏甲素對(duì)供試液、小鼠和胃吸收的干擾色譜柱:YMCPACKODS-A柱(150mm×4.6mm,5μm);流動(dòng)相:甲醇-0.1mol·L-1磷酸二氫鈉溶液(50∶50),流速:0.8mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng):252nm;柱溫:40℃;進(jìn)樣量:20μL。取氫溴酸高烏甲素對(duì)照液及小腸和胃吸收供試液分別經(jīng)0.22μm微孔濾膜,棄去初濾液,取續(xù)濾液20μL進(jìn)樣,在上述色譜條件下測(cè)定。色譜圖見圖1。由圖1可見供試液與氫溴酸高烏甲素對(duì)照液的峰保留時(shí)間一致,空白液在此條件下無干擾。該法最低檢測(cè)限為0.1μg·mL-1。1.2氫溴酸高烏甲基素濃度在腸道循環(huán)溶液中的測(cè)定1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別精密吸取氫溴酸高烏甲素儲(chǔ)備液(1g·L-1)0.05,0.1,0.15,0.2,0.25,0.3,0.4mL用K-R緩沖液定容至10mL,配成系列濃度的氫溴酸高烏甲素標(biāo)準(zhǔn)溶液,于0.22μm微孔濾膜過濾后,在上述色譜條件下進(jìn)樣20μL,以濃度(C)為橫坐標(biāo),以峰面積(A)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.2.2回收率與所需資源量試驗(yàn)精密吸取氫溴酸高烏甲素儲(chǔ)備液適量,用空白循環(huán)溶液稀釋配制得5.0,20.0,40.0mg·L-1的3種不同濃度氫溴酸高烏甲素供試品溶液,進(jìn)樣20μL,在上述色譜條件下測(cè)定,記錄色譜圖與峰面積,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。以測(cè)得濃度與實(shí)際濃度之比計(jì)算回收率。將上述配制的氫溴酸高烏甲素低、中、高3種濃度(5.0,20.0,40.0mg·L-1)的對(duì)照品溶液,按樣品測(cè)定方法測(cè)定。以1d內(nèi)測(cè)定的3次結(jié)果,計(jì)算日內(nèi)精密度,3d內(nèi)測(cè)定的3次結(jié)果計(jì)算日間精密度。1.3胃溶液中氫溴酸高烏甲基素濃度的測(cè)定1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密量取氫溴酸高烏甲素儲(chǔ)備液適量,用人工胃液稀釋為所需系列標(biāo)準(zhǔn)液,0.22μm微孔濾膜過濾,精密吸取20μL進(jìn)樣分析,在上述色譜條件下測(cè)定,以峰面積(A)為縱坐標(biāo),以濃度(C)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.3.2回收率試驗(yàn)精密吸取氫溴酸高烏甲素儲(chǔ)備液適量,用空白循環(huán)溶液稀釋配制得5.0,20.0,50.0mg·L-1的3種不同濃度氫溴酸高烏甲素供試品溶液,進(jìn)樣20μL,在上述色譜條件下測(cè)定,記錄色譜圖與峰面積,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。以測(cè)得濃度與實(shí)際濃度之比計(jì)算回收率。將上述配制的氫溴酸高烏甲素低、中、高3種濃度(5.0,20.0,50.0mg·L-1)的對(duì)照品溶液,按樣品測(cè)定方法測(cè)定。以1d內(nèi)測(cè)定的3次結(jié)果計(jì)算日內(nèi)精密度,3d內(nèi)測(cè)定的3次結(jié)果計(jì)算日間精密度。2藥物初始濃度和終濃度的計(jì)算選實(shí)驗(yàn)前禁食一夜(自由飲水)的大鼠,用20%烏拉坦腹腔注射麻醉(200mg·kg-1)麻醉大鼠,切開腹部,暴露胃,將賁門結(jié)扎,用玻璃插管插入幽門結(jié)扎之,用人工胃液將胃腔洗凈,注射器內(nèi)吸取胃試液10mL,注射4～5mL到胃內(nèi),然后又抽回到注射器重復(fù)幾次,使混合均勻,最后全部抽入注射器中,最后將4mL上述混合均勻的藥液注入胃內(nèi),注射器內(nèi)留下的藥液濃度為藥物初始濃度(C0),2h后從胃抽出藥液的濃度為藥物終濃度(Ct),根據(jù)氫溴酸高烏甲素初始濃度和終濃度計(jì)算其吸收率。3k-r樣品的制備將實(shí)驗(yàn)前禁食18h的大鼠稱重后,用20%烏拉坦腹腔注射麻醉(200mg·kg-1)麻醉大鼠,麻醉后將大鼠背位固定于手術(shù)臺(tái)板上,用白熾燈加熱保持37℃體溫,沿腹部正中線切開腹部(約3cm)。對(duì)需要考察的部位,在兩端剪切后插管,結(jié)扎,先用少量37℃的生理鹽水沖洗腸段,再用空氣將生理鹽水排凈。取供試液(預(yù)熱至37℃)100mL(記為V0),以2.5mL·min-1的流速循環(huán)10min后開始計(jì)時(shí),分別于回流0.25,0.5,0.75,1.0,1.5,2.0,3.0,4.0h取樣0.3mL,同時(shí)補(bǔ)充等量的等溫K-R溶液。樣品經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾,高效液相色譜法測(cè)定灌流液中藥物的濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,用空氣排出腸道內(nèi)殘留的藥液,測(cè)量灌流液的體積計(jì)為Vt。3.1藥物吸收百分率測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,小腸灌流液的體積有明顯的減少,為了準(zhǔn)確地計(jì)算吸收速率常數(shù),通過校正灌流液的體積便可以更準(zhǔn)確的計(jì)算得濃度。有文獻(xiàn)報(bào)道水分在腸道內(nèi)的吸收可以被描述為近似的零級(jí)動(dòng)力學(xué)過程。待測(cè)溶液的初始體積(V0)是確定的,試驗(yàn)結(jié)束后分別測(cè)定每只大鼠灌流液的末體積(Vt)。根據(jù)灌流液的初末體積計(jì)算出每個(gè)取樣點(diǎn)供試液的體積,根據(jù)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)藥物濃度和供試液體積計(jì)算出腸循環(huán)液中的剩余藥量Xr,以lnXr對(duì)取樣時(shí)間作圖得一直線,由直線的斜率求出吸收速率常數(shù)(Ka);由4h剩余藥量的變化值對(duì)初始藥量的比求出4h藥物吸收百分率。lnXr=lnX0-Ka×t吸收百分率/%=(V0C0-VtCt)/V0C0×1003.2藥物在各個(gè)腸段吸收速率的測(cè)定將濃度為20mg·L-1的氫溴酸高烏甲素供試液100mL,按上述方法操作,進(jìn)行大鼠十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸循環(huán)實(shí)驗(yàn),4h后考察藥物在各個(gè)腸段的吸收狀況。計(jì)算吸收速率并進(jìn)行t檢驗(yàn)。分段考察的各腸段區(qū)間如下:十二指腸段自幽門1cm處開始往下10cm止;空腸段自幽門15cm起往下10m止;回腸段自盲腸上行20cm開始往下10cm止;結(jié)腸段從盲腸后端開始往下10cm止。整腸段考察自十二指腸上端起到回腸下端止。3.3藥物濃度對(duì)腸吸收的影響用K-R溶液將藥物配制成濃度為10,20,40mg·L-1的供試品溶液,沿整腸段回流4h,依照“3”項(xiàng)下進(jìn)行操作,考察藥物濃度對(duì)腸吸收的影響。3.4p-糖蛋白抑制劑對(duì)藥物小鼠吸收的影響用K-R溶液將藥物配制成濃度為20mg·L-1的供試品溶液,加入100μmol·L-1的鹽酸維拉帕米作為P-糖蛋白抑制劑,沿整腸段回流4h,依照“3”項(xiàng)下進(jìn)行操作,考察P-糖蛋白抑制劑對(duì)藥物小腸吸收的影響。3.5灌流液中藥物濃度對(duì)藥物吸收的影響將十二烷基硫酸鈉(SDS),去氧膽酸鈉(SDC),癸酸鈉(SC)作為吸收促進(jìn)劑分別加入灌流液,使其在灌流液中的濃度達(dá)到0.2%(0.2g/100mL),藥物濃度均為20mg·L-1,沿整腸段灌流4h,測(cè)定藥物的吸收狀況。實(shí)驗(yàn)完畢后,取下實(shí)驗(yàn)?zāi)c段,用K氏液沖洗后,4%的甲醛固定,垂直切片,用蘇木紫-曙紅染色后,電子顯微鏡觀察。4試驗(yàn)液的穩(wěn)定性測(cè)定同上述方法操作,用K氏液在循環(huán)裝置中灌流4h,得空白腸循環(huán)液,以此空白腸循環(huán)液配制含氫溴酸高烏甲素20mg·L-1小腸循環(huán)液,置(37±0.5)℃水浴中孵育,分別于0,1,2,3,4h取樣,測(cè)定峰面積。結(jié)果顯示,4h測(cè)得供試液中LH的平均含量為0時(shí)刻的(100±1.52)%,說明4h內(nèi)氫溴酸高烏甲素在腸循環(huán)液中穩(wěn)定。為考察胃吸收過程中藥物的穩(wěn)定性,以人工胃液配制含氫溴酸高烏甲素20mg·L-1的供試液,置(37±0.5)℃水浴中孵育,分別于0,0.5,1,1.5,2h取樣,測(cè)定峰面積。結(jié)果表明2h內(nèi)氫溴酸高烏甲素在胃灌注液中穩(wěn)定,RSD為0.98%。結(jié)果1回收率及精密度人工胃液中氫溴酸高烏甲素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=20701C-165.8(r=0.9997),結(jié)果表明,氫溴酸高烏甲素在5～50mg·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好。高(50.0mg·L-1)、中(20.0mg·L-1)、低(5.0mg·L-1)濃度的平均回收率分別為97.78%,100.59%,100.78%(n=3);日內(nèi)精密度為0.41%,0.15%,0.02%(n=3);日間精密度為1.80%,1.40%,0.76%(n=3)。2回收率、精密度與定量限K-R緩沖液中氫溴酸高烏甲素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=22660C+280.27(r=0.9998),結(jié)果表明,氫溴酸高烏甲素在5～40mg·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好。高(40.0mg·L-1)、中(20.0mg·L-1)、低(5.0mg·L-1)濃度的平均回收率分別為99.88%,98.26%,98.24%(n=3);日內(nèi)精密度為0.50%,0.36%,0.21%(n=3);日間精密度為2.63%,1.85%,1.53%(n=3)。3物吸收百分率測(cè)定大鼠在體胃吸收實(shí)驗(yàn)2h后,求出藥物吸收百分率。由表1可見,氫溴酸高烏甲素在大鼠胃中2h僅吸收9.67%,胃部為該藥物吸收的不良部位。4藥物在腸道的吸收4.1不同腸段氫溴酸高烏甲素吸收部位的檢測(cè)氫溴酸高烏甲素溶液在各腸段的吸收速率常數(shù)(Ka)和吸收百分率(%)見表2。十二指腸是氫溴酸高烏甲素較佳的吸收部位,與其他腸段比較均有顯著性差異(P<0.05);而空腸與回腸之間無顯著性差異(P>0.05),它們的吸收速率相近,結(jié)腸吸收最差。4.2循環(huán)前后的吸收量和吸收速率和速率常數(shù)高中低3個(gè)濃度的供試品溶液,沿整腸段回流4h后,求出不同濃度藥物循環(huán)后的吸收量和吸收速率常數(shù),結(jié)果見表3。結(jié)果表明,在10～40mg·L-1內(nèi)藥物的吸收量與質(zhì)量濃度呈正相關(guān),沒有飽和吸收現(xiàn)象,并且吸收速率常數(shù)幾乎保持不變,初步判斷其吸收有可能是被動(dòng)擴(kuò)散的結(jié)果。4.3p-糖蛋白抑制劑對(duì)段小鼠吸收速率的影響小腸灌流液中加入P-糖蛋白抑制劑后,氫溴酸高烏甲素溶液在整段小腸內(nèi)的吸收速率常數(shù)(Ka)和吸收百分率(%)見表4,結(jié)果表明,P-糖蛋白抑制劑組增加了藥物的小腸吸收,原藥組和P-糖蛋白抑制劑組的吸收百分率具有顯著性差異(P<0.05)。4.4對(duì)藥物的吸收與中濃度藥物在大鼠小腸內(nèi)吸收的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比,吸收促進(jìn)劑十二烷基硫酸鈉、膽酸鈉和癸酸鈉對(duì)藥物在小腸內(nèi)的吸收具有明顯的促進(jìn)作用(P<0.01)。三者促進(jìn)藥物吸收的倍數(shù)分別是1.29,1.31,1.53倍。結(jié)果見表5。4.5組織病理學(xué)檢測(cè)吸收促進(jìn)劑對(duì)小腸黏膜毒性較大,為了評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)中用到的促透劑毒性大小,將實(shí)驗(yàn)?zāi)c段進(jìn)行常規(guī)處理后,進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)價(jià)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),十二烷基硫酸鈉和去氧膽酸鈉對(duì)小腸黏膜造成了不同程度的改變,如小腸絨毛脫落和倒伏,小腸上皮細(xì)胞脫落,炎性細(xì)胞增加。相比之下,癸酸鈉對(duì)小腸黏膜造成的毒性最小,結(jié)果見圖2。優(yōu)化藥物生物利用度在體小腸吸收實(shí)驗(yàn)中,由于腸道吸收水分導(dǎo)致灌流液體積減少,因此,進(jìn)行藥物吸收動(dòng)力學(xué)的研究時(shí)為了標(biāo)示灌流液體積變化,國(guó)內(nèi)常采用酚紅作為標(biāo)記物。一般的腸吸收理論中認(rèn)為:酚紅為一離子型化合物,在小腸內(nèi)不吸收。但有文獻(xiàn)報(bào)道酚紅可以從小腸吸收,平均吸收速率約6%,1.0mmol·L-1酚紅(pH6.5磷酸緩沖液)能從小腸吸收,并在1h血藥濃度達(dá)峰值3nmol·mL-1,因此不能用酚紅來標(biāo)示在體小腸吸收模型中灌流液的體積變化,否則將導(dǎo)致藥物吸收速率偏小,尤其是難吸收藥物,有時(shí)將得出錯(cuò)誤的結(jié)論。本研究的創(chuàng)新之處在于采用了與以往文獻(xiàn)所報(bào)道的不同的方法,用體積法校正水分的吸收,此方法較簡(jiǎn)單,且得出的結(jié)果更為準(zhǔn)確。十二指腸為氫溴酸高烏甲素的最佳吸收部位,提示可應(yīng)用制劑學(xué)方法控制氫溴酸高烏甲素在十二指腸的滯留時(shí)間,以提高其吸收程度,從而提高其生物利用度。本研究還得出P-糖蛋白抑制劑維拉帕米可增加藥物從小腸的吸收,因此在臨