第六章 酶的發(fā)酵生產(chǎn)

第六章酶的發(fā)酵生產(chǎn)一、微生物酶工業(yè)的發(fā)展概況二、酶的生產(chǎn)菌種三、酶生物合成調(diào)節(jié)的基本理論四、酶的發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)五、酶發(fā)酵動力學(xué)六、微生物酶制劑生產(chǎn)工藝舉例1第一節(jié)、概述酶是由細(xì)胞產(chǎn)生的具有催化作用的蛋白質(zhì)，生物體進(jìn)行的各種生物化學(xué)反應(yīng)都是在酶的作用下進(jìn)行的，沒有酶，代謝就會停止，生命也會停止?，F(xiàn)代意義的酶，已經(jīng)不單單是一些微生物的重要產(chǎn)物，它已成為現(xiàn)代生物產(chǎn)業(yè)中的一個不可缺少的組成部分。酶作為生物催化劑，在許多化學(xué)反應(yīng)中具有不可低估的作用。酶催化劑作為生物進(jìn)化的高級形式，與一般的化學(xué)催化劑相比，它可以在非常溫和的條件下高效、專一性地將催化底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物。2通過酶，尤其是固定化酶的催化作用，可以簡化生產(chǎn)工藝、降低生產(chǎn)成本、改善操作環(huán)境，其經(jīng)濟(jì)效益是非?？捎^的。隨著人們對環(huán)境保護(hù)和生活質(zhì)量要求的提高，酶在醫(yī)藥、食品、輕工等領(lǐng)域的應(yīng)用是益廣泛。酶工程技術(shù)已成為生物工程技術(shù)的重要組成部分，無論在基因工程、蛋白質(zhì)工程、細(xì)胞工程和發(fā)酵工程都需要酶分子的參與。酶催化的高效、特異性、產(chǎn)品的高效回收和反應(yīng)體系簡單等優(yōu)點使酶工程技術(shù)成為現(xiàn)代生物技術(shù)的主要支柱之一。3酶對作用物具有高度的專一性、嚴(yán)格的選擇性，只對某一種物質(zhì)起催化作用。有的酶單一使用就可起催化作用，有的則需加上輔酶或輔基等輔助因子才能完成催化作用。酶的催化作用受到溫度、酶濃度、pH值、激活劑、酶抑制劑等條件的影響。大多數(shù)生物都是有用酶的來源,但實際上只有有限數(shù)量的植物和動物是經(jīng)濟(jì)的酶源,在工業(yè)生產(chǎn)中所用的酶制劑絕大部分是通過微生物發(fā)酵、提取、精制而獲得。全世界已發(fā)現(xiàn)的酶有3000多種，目前工業(yè)生產(chǎn)的有60多個產(chǎn)品，達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模的僅有20多個產(chǎn)品。4一、微生物酶工業(yè)的發(fā)展概況1、酶制劑的發(fā)展歷史人類利用微生物生產(chǎn)酶具有悠久的歷史，最有代表性的就是制曲釀酒。公元前12世紀(jì)周代人們釀酒，制作飴糖和醬，2000多年前，春秋戰(zhàn)國時期已知用曲治療消化不良的疾病519世紀(jì)末酶蛋白學(xué)術(shù)的建立，開創(chuàng)了酶工業(yè)生產(chǎn)的歷史。1949年日本開始用深層培養(yǎng)法生產(chǎn)細(xì)菌α－淀粉酶。隨著酶工業(yè)提純技術(shù)的進(jìn)步和應(yīng)用領(lǐng)域的開發(fā)，果膠酶、葡萄糖氧化酶等也相繼進(jìn)入了工業(yè)化生產(chǎn)階段。70年代后固定酶技術(shù)的發(fā)展，加速了酶制劑工業(yè)的發(fā)展。相繼開發(fā)了脂肪酶、微生物凝乳酶、柚苷酶、磷酸二酯酶等。近年來又開發(fā)了青霉素?；浮惖矸勖傅鹊?。62、國內(nèi)外酶制劑生產(chǎn)和應(yīng)用現(xiàn)狀世界三大酶制劑公司NovoNordisk（丹麥）GenencorInternational(美國）Cuitor(芬蘭）三大公司銷售額占世界總額的70%73、我國酶工業(yè)發(fā)展階段1965無錫酶制劑廠淀粉酶1979糖化酶堿性蛋白酶中性蛋白酶1993耐高溫淀粉酶1998國外大公司紛紛入駐1999年投產(chǎn)目前我國已能生產(chǎn)α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、中性脂肪酶、青霉素酰化酶、果膠酶、纖維素酶、飼料用復(fù)合酶、葡萄糖異構(gòu)酶、凝膠酶。年產(chǎn)量260多萬噸。8酶制劑的產(chǎn)業(yè)規(guī)模

酶制劑總規(guī)模（2004年）：670億元水解酶31％蛋白酶59％其它10％堿性蛋白酶25％中性蛋白酶12％凝乳酶10％淀粉酶5％糖化酶13％葡萄異構(gòu)酶6％果膠酶3％纖維素酶1％9一、概述二、脂肪酶的一般性質(zhì)三、產(chǎn)酶微生物及其篩選四、酶活的測定五、發(fā)酵工藝和酶的提取六、國內(nèi)外研究情況七、參考文獻(xiàn)蛋白酶、果膠酶、葡萄糖異構(gòu)酶、

纖維素酶、糖化酶、脂肪酶10二、酶制劑的應(yīng)用食品工業(yè)洗滌劑纖維工業(yè)有機合成和制藥工業(yè)醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用用于分析化學(xué)和臨床檢驗生物工程11國際市場酶制劑銷售額比例

2001年工業(yè)酶制劑的世界市場約為15億美元用于制藥工業(yè)與精細(xì)化學(xué)工業(yè)約1.2億~1.5億美元1213淀粉酶類與淀粉糖業(yè)14果汁生產(chǎn)與果膠酶乳制品與凝乳酶15酶制劑在國外飼料工業(yè)中得到不斷應(yīng)用，不僅提高了飼料原料的轉(zhuǎn)化率，也促進(jìn)了對飼料的消化。植酸酶

Bio-Feed?Phytase(Ronozyme?P)

主要用于提高植酸磷的消化率，并相應(yīng)改善鈣和其它礦物元素的利用率。大大降低了動物糞便中磷的排放量，有益環(huán)保。16酶水解了毛根部的毛囊蛋白而使毛松動脫落。蛋白酶分解皮纖維間質(zhì)中的可溶性蛋白質(zhì)，使皮纖維進(jìn)一步松散軟化。加速蛋白質(zhì)的分解染色溫度降低皮革脫毛與軟化加酶洗滌劑生絲脫膠與羊毛染色蛋白酶回本章目錄17青霉素?；概c抗生素改造18溶菌酶19凝血酶20健美生消化酶—幫助腸胃蠕動【產(chǎn)品規(guī)格】90片／瓶【食用方法】成人每日3片，隨主餐服用【成分(每片含)】1)消化蛋白質(zhì)：木瓜蛋白酶50毫克、菠蘿蛋白酶30毫克；2)消化脂肪：脂肪酶30毫克；3)消化碳水化合物/淀粉：淀粉酶50毫克；4)消化乳制品：乳糖酶30毫克；5)消化纖維：纖維素酶15毫克。另含：能抑制過多胃酸的葡萄糖酸鈣，能緩解反胃薄荷葉和茴香【適用人群】·消化不良者·腸胃疾病患者·大病初愈者消化酶類21SOD22生物拋光是一種用纖維素酶改善纖維素纖維制品表面的整理工藝,以達(dá)到持久的抗起毛起球并增加織物的光潔度和柔軟度

23三、酶制劑的生產(chǎn)方式1.固態(tài)發(fā)酵法微生物的培養(yǎng)物是固態(tài)，一般使用麩皮、米糠作為培養(yǎng)基。在曲房內(nèi)將培養(yǎng)基拌入種曲后（固態(tài)，含水量60％左右）鋪成薄層（1cm左右）在曲盤或簾子上，然后置于多層架子上進(jìn)行微生物的培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中控制曲房的溫度和濕度（90～100％），逐日測定酶活力的消長，待菌絲布滿基質(zhì)、酶活力達(dá)到最大值不再增加時，即可終止培養(yǎng)，進(jìn)行酶的提取。固態(tài)培養(yǎng)法一般適用于霉菌的生產(chǎn)。起源于我國釀造生產(chǎn)特有的傳統(tǒng)制曲技術(shù)，生產(chǎn)簡單易行，但勞動強度高。近年新發(fā)展了通風(fēng)制曲工藝，在酶制劑的生產(chǎn)中仍占有重要作用。242.深層液體培養(yǎng)法采用在通風(fēng)攪拌的發(fā)酵罐中進(jìn)行微生物深層液體培養(yǎng)，是目前酶制劑發(fā)酵生產(chǎn)中最廣泛應(yīng)用的方法。液體深層發(fā)酵法的優(yōu)點機械化程度高，發(fā)酵條件易控制。酶的產(chǎn)率高、質(zhì)量好。培養(yǎng)的無菌要求高，在生產(chǎn)上要特別注意防止染菌。25第二節(jié)酶的生產(chǎn)菌種1．酶發(fā)酵生產(chǎn)的細(xì)胞必需具備如下條件①易于快速繁殖，產(chǎn)生大量健壯的營養(yǎng)細(xì)胞、孢子或其它繁殖體。②菌種不易變易退化，不易感染噬菌體。③酶的產(chǎn)量高；產(chǎn)酶穩(wěn)定性好；④容易培養(yǎng)和管理；發(fā)酵周期短，營養(yǎng)需求簡單；產(chǎn)物雜質(zhì)少，利于酶的分離純化；⑤安全可靠，非致病性。262．常見酶發(fā)酵生產(chǎn)用微生物

微生物主要功能枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis

-淀粉酶，中性蛋白酶、β葡聚糖酶大腸桿菌Esherichiacoli

－半乳糖苷酶，谷氨酸脫羧酶，天門冬酸酶，芐青霉素?；?，限制性核酸內(nèi)切酶，DNA聚合酶，DNA連接酶，核酸外切酶黑曲霉Aspergillusniger糖化酶，果膠酶，纖維素酶，半纖維素酶，葡萄糖，氧化酶，酸性蛋白酶，柚苷酶米曲霉Aspergillusoryzae淀粉酶，中性蛋白酶，果膠酶，氨基?；浮⒅久?，磷酸二酯酶根霉屬Rhizopus糖化酶，轉(zhuǎn)化酶，脂肪酶，酸性蛋白酶，半纖維素酶毛霉Mucor蛋白酶，糖化酶，脂肪酶，凝乳酶27產(chǎn)黃青霉Penicillium

chrysogenum葡萄糖氧化酶，青霉素?；?，果膠酶，纖維素酶，桔青霉，5‘－磷酸二酯酶，脂肪酶，葡萄糖氧化酶，核酸酶，凝乳蛋白酶，木霉屬Trichoderma纖維素酶，17

-羥化酶鏈霉菌Streptomyces葡萄糖異構(gòu)酶，中性蛋白酶，幾丁質(zhì)酶釀酒酵母Saccharomycescerevisiae轉(zhuǎn)化酶假絲酵母Candida脂肪酶，轉(zhuǎn)化酶，尿酶，乳糖酶脆壁酵母乳糖酶28枯草芽孢桿菌純培養(yǎng)的鏡下形態(tài)（革蘭染色）枯草芽孢桿菌在營養(yǎng)瓊脂平板上的菌落特征（18～24h）29枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)

30大腸埃希氏桿菌醋酸桿菌（Acetobacter）31圖2-84釀酒酵母32毛狀菌落（絲狀真菌菌落形態(tài)之一）毛霉總狀毛霉（PDA）33根霉的假根根霉形態(tài)和囊托照片

34少根根霉（低倍鏡見假根）35（曲霉）分生孢子頭、分生孢子梗、足細(xì)胞黑曲霉（蔡氏培養(yǎng)基）36日本曲霉（蔡氏培養(yǎng)基）37日本曲霉（頂囊球形，小梗單層）黑曲霉（頂囊球形，小梗雙層）38解脂假絲酵母解脂變種393、工業(yè)規(guī)模應(yīng)用的微生物酶和它們的某些來源40酶作用特性產(chǎn)酶微生物用途α-淀粉酶（液化酶，中溫）切淀粉內(nèi)部1，4糖苷鍵；pH6.0-7.0；T-60-70℃；產(chǎn)物糊精枯草芽胞桿菌地衣芽胞桿菌米曲霉食品，淀粉液化，織物退漿，消化助劑，加酶洗滌劑β-淀粉酶（1，4麥芽糖苷酶）切淀粉非還原型末端1，4糖苷鍵；pH6.5；T-50℃；產(chǎn)物麥芽糖。巨大芽胞桿菌啤酒制造葡萄糖淀粉酶（糖化酶，1，4葡萄糖苷酶）切淀粉分子非還原性末端；pH4.0-4.5；T-58-60℃主要是曲霉（佐美曲霉，泡盛曲霉）、根霉（雪白根霉，德氏根霉）制造葡萄糖，發(fā)酵氨基酸、釀酒等工業(yè)的淀粉水解糖。耐高溫淀粉酶內(nèi)切淀粉酶，隨機水解淀粉、糊精、低聚糖的α-糖苷鍵。pH5.5-7.0；T-100-105℃白地霉發(fā)酵淀粉原料的轉(zhuǎn)化異淀粉酶支鏈淀粉α-1，6糖苷鍵形成直鏈淀粉和糊精；pH5.6-7.2；T-45-50℃產(chǎn)氣克雷伯氏菌，芽孢桿菌制造直連淀粉加工；麥芽糖4142酶作用特性產(chǎn)酶微生物用途酸性蛋白酶酸性介質(zhì)中水解動植物蛋白質(zhì)；pH2.5-4.0；T-30-50℃；黑曲霉、米曲霉、根霉、微小毛霉、擬青霉、青霉皮革軟化，果汁澄清，啤酒去濁，蛋白質(zhì)水解液制備，羊毛染色，飼料添加劑。中性蛋白酶pH6.8-8.0；T-50℃；枯草芽胞桿菌，巨大芽孢桿菌，臘狀芽孢桿菌，米曲霉，棲土曲霉、灰色鏈霉菌皮革、毛皮加工，食品加工，調(diào)味品制造、助消化、消炎、啤酒澄清，蛋白質(zhì)水解液制備，羊毛染色。堿性蛋白酶pH10-11；T-40-50℃；枯草芽胞桿菌，巨大芽孢桿菌，臘狀芽孢桿菌，米曲霉，棲土曲霉、灰色鏈霉菌地衣芽胞桿菌加酶洗滌劑植酸酶黑曲霉，畢赤酵母工程菌株飼料添加劑43纖維素酶包括內(nèi)切β-1，4葡聚糖酶（Cx）；外切葡聚糖酶（C1）；纖維二糖酶（β葡萄糖苷酶）；有效pH2.8-5.8；T-45-60℃；綠色木霉，里氏木霉、康氏木霉，黑曲霉，青霉紡織工業(yè)（水洗布生產(chǎn)），飼料添加劑，消化植物細(xì)胞壁，食品工業(yè)，石油工業(yè)半纖維素酶木霉、曲霉、根霉飼料添加劑，消化植物細(xì)胞壁，低聚木糖生產(chǎn)β葡聚糖酶枯草芽胞桿菌，黑曲霉，Penicilliumemersonii啤酒釀造，飼料添加劑乳糖酶乳酸酵母，米曲霉，黑曲霉，米根霉乳品工業(yè)（處理牛乳和乳清）果膠酶曲霉、歐文氏菌水果加工，果汁、果酒澄清，麻類纖維脫膠44工業(yè)規(guī)模應(yīng)用的微生物酶和它們的某些來源轉(zhuǎn)化酶啤酒酵母、假絲酵母制造轉(zhuǎn)化糖凝乳酶米赫毛霉,大腸桿菌和真菌生產(chǎn)的重組酶制造乳酪脂肪酶曲霉、根霉、酵母等加酶洗滌劑，油脂加工，生物化工葡萄糖氧化酶青霉、曲霉食品去氧、除葡萄糖，測定葡萄糖葡萄糖異構(gòu)酶凝結(jié)芽胞桿菌，白色鏈霉菌生產(chǎn)果葡糖漿青霉素?；讣?xì)菌、霉菌、放線菌制造6-氨基青霉烷酸454、酶在食品工業(yè)中應(yīng)用的案例

----啤酒行業(yè)酶制劑應(yīng)用概述及展望46（1）酶制劑在啤酒行業(yè)的應(yīng)用情況：利用現(xiàn)代化生物化學(xué)技術(shù)，并與傳統(tǒng)啤酒釀造技術(shù)相結(jié)合，對提高啤酒質(zhì)量降低生產(chǎn)成本、增加效益都大有益處。啤酒中使用外加酶制劑的用途：提高輔料比例：改善啤酒口味，降低成本。提高發(fā)酵度：提高啤酒發(fā)酵度，為生產(chǎn)新品種干啤酒提供了基礎(chǔ)。彌補麥芽質(zhì)量差的問題：由于麥芽質(zhì)量不佳，會出現(xiàn)糖化不完全、過濾速度慢、收率低等現(xiàn)象，而添加必要的酶制劑可以彌補麥芽質(zhì)量的不足。提高質(zhì)量：添加酶制劑，生產(chǎn)不同品種的啤酒，由于可不使用麥芽糊化，可減少麥皮中色素、單寧等不良雜質(zhì)在糖化過程中浸出，因而在保證啤酒色度、品味及非生物穩(wěn)定性方面有一定的效果。操作方便。使用耐高溫α-淀粉酶可迅速升溫，液化徹底，便于控制。減少成品中雙乙酰含量，使成品符合標(biāo)準(zhǔn)。提高啤酒非生物穩(wěn)定性，使酒質(zhì)清澈透明。提高設(shè)備利用率，便于高濃度糖化工藝要求。47（2)、啤酒生產(chǎn)參考用酶48

啤酒釀造中主要使用的酶制劑：啤酒生產(chǎn)中，外加酶制劑的品種很多，而且新的酶制劑品種還在不斷被研發(fā)出來，并在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。表1列出了目前啤酒生產(chǎn)中主要使用的酶制劑種類及簡單說明，其中推薦的使用量僅供參考，具體用量，需根據(jù)實際情況而定。49產(chǎn)品產(chǎn)生菌推薦用量應(yīng)用說明耐酸、耐高溫α-淀粉酶地衣芽孢桿菌（Bacillulicheniformis）0.04%~0.06%(對淀粉干基計)添加在湖化鍋中，用于大米等淀粉質(zhì)輔料的液化。糖化酶黑曲霉(Aspergillusniger)米曲霉(Aspergillusoryzae)0.05%~0.1%(對淀粉干基計)糖化酶可提高麥汁的可發(fā)酵性糖，改變麥汁的組分，對于干爽型的啤酒和低熱能啤酒的釀造，可在糖化時添加。β－淀粉酶植物中提取(大麥和麥芽)0.10~0.20/L麥汁本產(chǎn)品是從大麥中提取，可水解淀粉為麥芽糖，在啤酒釀造中，可用于提高麥汁糖分；與普魯蘭酶合用，可用于干爽型和低糖啤酒的生產(chǎn)真菌淀粉酶曲米霉菌株(Aspergillusoryzae)0.3Kg/噸原料（麥芽和輔料）20-30g/噸冷麥汁本產(chǎn)品可提高發(fā)酵度，改善殘?zhí)锹?；提高發(fā)酵速度，“冷混濁”；麥汁香味修飾?？商砑拥桨l(fā)酵罐中普魯蘭酶(鏈淀粉酶)異淀粉酶普魯蘭桿菌菌株(Bacilluacidopullulgticus)0.1-1.5Kg/噸淀粉干物質(zhì)普魯蘭酶可提高麥汁的可發(fā)酵度和改變麥汁糖化的組分，對于干爽型啤酒和低熱能啤酒的釀造，可在糖化時添加。糖化復(fù)合酶（糖化酶＋普魯蘭酶）0.05~0.1%(對淀粉干基計)與上述的糖化酶和普魯蘭酶的作用相同，但比糖化酶和普魯蘭酶單獨添加更有效。50產(chǎn)品產(chǎn)生菌推薦用量應(yīng)用說明中性蛋白酶黑曲霉(Aspergillusniger)宇佐美曲霉(Aspergillususamii)棲土曲霉(Aspergillusterricola)放線菌(Astinomycessp.)地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)0.3-0.7kg/噸麥芽增加α－氨基酸，防止啤酒混濁，改善麥芽質(zhì)量，加快過濾速度，得到好的泡沫。β－葡聚糖酶枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)綠色木霉(Trichodermaviride)0.2-0.6kg/噸(麥芽粉干基計)本產(chǎn)品可分解葡聚糖、木聚糖及其它膠質(zhì)成分。在糖化鍋添加，用于降低麥芽和大米中上述碳水合物引起的麥汁粘度，加快過濾速率，同時可提高麥汁的轉(zhuǎn)化率；消除成品酒“冷混濁”現(xiàn)象，在純生啤酒生產(chǎn)中大幅提高清酒過濾的速率。α－乙酰乳酸脫羧酶枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)綠色木霉(Trichodermaviride)1-2kg/1000hl麥芽汁減少和防止形成雙乙酰，可以大大縮短發(fā)酵后熟期。葡萄糖氧化復(fù)合酶（葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶、轉(zhuǎn)化酶）2-3mg/kg啤酒通過催化啤酒中葡萄糖的氧化反應(yīng)而消耗氧，來除去啤酒中的溶解氧和瓶頸空間的氧，使啤酒口味明顯好轉(zhuǎn)，老化味減輕，澄清度提高，延長保質(zhì)期，可在清酒中添加。溶菌酶從雞蛋中提取1-10mg/kg清酒通過破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁從而消除引起腐敗的革蘭氏陽性細(xì)菌?？杉佑诮湍钢校瑧?yīng)用于清酒和鮮啤中。51產(chǎn)品產(chǎn)生菌推薦用量應(yīng)用說明各種復(fù)合酶根據(jù)需要對選擇外加酶制劑進(jìn)行組合。根據(jù)實際情況而定復(fù)合酶是一種啤酒行業(yè)優(yōu)化的酶制劑。根據(jù)需要和各酶的活性特點進(jìn)行合理匹配，滿足不同要求。.木瓜蛋白酶一種高活性的植物蛋白酶10g/噸啤酒可迅速將啤酒中的大分子量蛋白質(zhì)降解為易溶于啤酒的中分子、小分子蛋白質(zhì)，能縮短發(fā)酵時間，有利于啤酒澄清和雙乙酰還原。轉(zhuǎn)苷酶是曲霉經(jīng)控制發(fā)酵而得0.5-1.0kg/噸麥汁降低可發(fā)酵性糖，生產(chǎn)低醇啤酒。脯氨酸內(nèi)切酶基因修飾技術(shù)改良黑曲霉經(jīng)控制發(fā)酵而得4-15ppm能有效延長啤酒非生物穩(wěn)定性，對泡沫有一定影響。52（3）、啤酒中外加酶的具體應(yīng)用：外加酶制劑使用注意事項：生產(chǎn)中應(yīng)根據(jù)原料和工藝狀況有針對性地精選外加酶制劑，對于效果不明顯，作用不突出、介于可用不可用的情況，應(yīng)堅決不使用。因為酶制劑屬于生物制品，大多由微生物發(fā)酵而來，不恰當(dāng)?shù)氖褂?，將給啤酒生產(chǎn)帶來不利影響，甚至是污染。酶制劑的用量應(yīng)在保證其作用效果的前提下選擇最低的添加量，除成本原因外，過量使用酶制劑會造成底物過度分解，在工藝和啤酒口感方面容易出現(xiàn)異常。甚至有些酶的失活溫度很高，過量添加，酶制劑將在啤酒成品中繼續(xù)分解底物，造成產(chǎn)品質(zhì)量異常。酶制劑添加時要考慮其純度。純度低使酶的用量加大，并且其無效的雜質(zhì)會影響啤酒質(zhì)量；其它雜酶會催化底物生成一些不需要的物質(zhì)，對啤酒的泡沫、口味和氣味造成不利影響。53酶活力是研究酶特性和應(yīng)用時一項必須考慮的指標(biāo)，也是決定產(chǎn)品價格和添加量的主要因素。選擇高活力的酶制劑將在一定程度上減少使用劑量，被酶中的雜酶、雜質(zhì)和少量微生物污染的機會將減少。啤酒廠家應(yīng)完善對酶活力的檢測手段。由于酶制劑大多由細(xì)菌或霉菌發(fā)酵生成（少量從植物中提取的酶除外），同時衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)允許酶制劑中存在一定量的活菌數(shù)，因此在發(fā)酵和清酒環(huán)節(jié)添加的酶制劑，很容易將耐熱菌和孢子帶入成品酒，若巴氏殺菌強度不夠，會嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)量。因此要對其高度重視，盡量減少外加酶制劑的微生物染污。酶制劑使用時應(yīng)注意添加細(xì)節(jié)，此過程對其作用效果的發(fā)揮有很大影響。溫度、pH的變化會使酶產(chǎn)生變性，甚至在一定的溫度范圍內(nèi)，pH對酶產(chǎn)生的影響要遠(yuǎn)大于溫度的變化對酶的影響，因此在生產(chǎn)中有必要先調(diào)整好pH之后再加入酶。否則酶作用效果不好，或造成酶不可逆變性。此外糖化并醪過程應(yīng)精心控制，不可出現(xiàn)溫度偏高再降溫的情況，高溫將導(dǎo)致酶失活，且無法挽回。54酶制劑在啤酒生產(chǎn)過程中的應(yīng)用：a、啤酒中輔料液化用酶：為降低生產(chǎn)成本，啤酒生產(chǎn)中廣泛利用各種淀粉質(zhì)原料如大米、玉米、小麥等作用輔料，用量一般占３０％，甚至更高；生產(chǎn)中采用耐高溫α－淀粉酶作為淀粉質(zhì)輔料的液化用酶，所生產(chǎn)的淡爽型口味啤酒受到消費者普遍歡迎。b、提高發(fā)酵度：發(fā)酵度是指原麥汁中的浸出物被酵母發(fā)酵所消耗的量與原浸出物總量的比值。在生產(chǎn)干啤，淡爽型啤酒時，為增加可發(fā)酵性糖，提高發(fā)酵度，可外加高轉(zhuǎn)化率液體糖化酶、β－淀粉酶、真菌淀粉酶、切支酶（如：普魯蘭酶、異麥芽糖酶）等。c、降低雙乙酰：用來降低啤酒發(fā)酵液中雙乙酰含量，縮短啤酒酒齡，加快啤酒成熟。d、改善麥汁過濾：麥汁經(jīng)過糖化后立即過濾，除去麥糟，以免影響色、香、味。麥汁粘度對過濾速度的影響很大。溫度高時則粘度小，過濾快；此外原料粉碎度直接影響濾層可透性，粉碎度不宜太細(xì)。當(dāng)輔料比增加時，麥芽相對減少，麥芽中降解β-葡聚糖的酶系不足；或者麥芽質(zhì)量差，在麥汁中的β-葡聚糖沒有完全分解，使麥汁過濾困難。同時也有可能影響啤酒過濾、風(fēng)味和引起混濁。一般可在糖化時加入β-葡聚糖酶，可達(dá)到過濾速度加快的目的。55新研究表明，其它多聚糖對過濾速度也存在很大的影響，尤其是戊聚糖，因為這種多聚糖含有木聚糖的主鏈,因此人們越趨向于使用帶有戊聚糖酶制劑和其它膠質(zhì)水解活性的β-葡聚糖復(fù)合酶制劑。這樣可使麥汁過濾速度大大提高，酒糟中殘留的麥汁量減少；原料細(xì)胞壁的框架物質(zhì)被分解，促進(jìn)糖化酶系作用，尤其是可以提高蛋白酶的作用效果，提高麥汁中α-氨基氮的含量，這有利于啤酒酵母的發(fā)酵，提高麥汁產(chǎn)量和收率，縮短熱麥汁被氧化的時間，減輕氧化程度，有利于提高啤酒質(zhì)量；由于粘度降低，有利于酵母沉降，使發(fā)酵液澄清度提高，發(fā)酵液中酵母數(shù)的減少，使硅藻土的堵塞機率大大減小，因此過濾量有了很大提高，啤酒的膠體穩(wěn)定性得到有效改善；同時清酒的過濾速度也得以加快，提高糖化設(shè)備利用率，能降低麥汁濁度，對提高啤酒的非生物穩(wěn)定性有較大促進(jìn)作用。e、增加a-氨基氮：α-氨基氮是酵母進(jìn)行發(fā)酵的主要氮源，如果為酵母提供的游離氨基氮不足的活，發(fā)酵將不甚理想，導(dǎo)致啤酒質(zhì)量低劣，而在糖化工序中加入中性蛋白酶，可以增加麥芽中的游離氨基氮含量。同時中性蛋白酶可使原料中的可溶性蛋白質(zhì)很好地提取出來，并使啤酒產(chǎn)生良好的泡沫。56f、提高啤酒非生物穩(wěn)定性：啤酒穩(wěn)定性是啤酒保質(zhì)、保鮮的能力。造成啤酒不穩(wěn)定的因素很多，大致可分為生物混濁和非生物混濁兩種。非生物混濁在啤酒混濁中是主要的，而非生物混濁中蛋白質(zhì)引起的混濁又是主要的，約占90%以上，如啤酒巴氏滅菌后不久，出現(xiàn)熱凝固蛋白沉淀，這是由于麥汁煮沸強度不夠而析出；麥芽中的β－球蛋白與麥汁中的大麥表皮和酒花中的花色苷以氫鍵結(jié)合，也形成沉淀。為解決冷濁蛋白質(zhì)引起的混濁問題，可添加酸性蛋白酶－木瓜蛋白酶（酶清）或菠蘿蛋白酶分解蛋白質(zhì)，木瓜蛋白酶是一種半胱氨酸蛋白酶，它可以分解與多酚相關(guān)的啤酒中的蛋白質(zhì)而避免成品啤酒的冷混濁，同時并不對啤酒中形成泡沫的蛋白質(zhì)起作用。脯氨酸內(nèi)切酶：DSM公司產(chǎn)品，是黑曲霉經(jīng)基因修飾改良發(fā)酵控制生產(chǎn)得到的酶制劑，對啤酒非生物穩(wěn)定性效果明顯。57g、復(fù)合作用：隨著酶制劑生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展，以及工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用技術(shù)的提高，國內(nèi)外酶制劑公司紛紛生產(chǎn)出各種性能的多功能復(fù)合酶。復(fù)合酶是采用發(fā)酵方法，生產(chǎn)以某種酶制劑為主，其化酶為輔的產(chǎn)品，也有將幾種性能和功用近似的配套合并在一起組成復(fù)合酶，由于復(fù)合酶的協(xié)同和互補作用，可以提高產(chǎn)品的收得率和設(shè)備利用率?，F(xiàn)將主要復(fù)合酶列舉如下。1).復(fù)合酶＝糖化酶＋普魯蘭酶2).復(fù)合酶＝中性蛋白酶＋中溫淀粉酶＋β－葡聚糖酶3).復(fù)合酶＝中性蛋白酶＋β－葡聚糖酶＋半纖維素酶＋α—淀粉酶4).復(fù)合酶＝蛋白酶復(fù)合粉劑＋糖化酶5).復(fù)合酶＝異淀粉酶＋極限糊精酶必需指出，復(fù)合酶的應(yīng)用目的必須明確，其主要功能是什么?輔助功能是什么?不可能依靠復(fù)合酶來解決所有酶的作用。應(yīng)用時，其酶解條件也應(yīng)以主要酶的工藝特性為主，盡可能滿足主要酶所需的工藝條件，兼顧其他輔助酶，58h、其它：除以上提到的酶制劑品種以外，還有很多可以滿足其他工藝的酶制劑種品，如在純生啤酒的生產(chǎn)中為改善膜過濾速度，可以采用耐熱真菌β－葡聚糖復(fù)合酶（含木聚糖酶和半纖維素酶，其作用是改善純生啤酒的膜過濾效果；提高麥汁提取收率及過濾速度，增加硅藻土過濾啤酒每批的過濾量。消除由β－葡聚糖而引起的成品酒“冷混濁”。此外在生產(chǎn)扎啤、桶啤、鮮啤和純生啤酒時防腐保鮮十分重要，從啤酒受微生物污染分析中看到，乳酸桿菌約占６０％，果膠桿菌占２１％，巨形環(huán)菌屬和片環(huán)菌約占３％左右，其他微生物占７％，采用高效溶菌酶可以抑殺有害菌。溶菌酶是一種催化細(xì)菌細(xì)胞壁中的肽多糖的水解，它專一地作用肽多糖分子N－乙酰胞壁酸與N－乙酰氨基葡萄糖之間的β－１，４鍵，從而破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁，使細(xì)胞因水解死亡，溶菌酶對酵母不起作用，它能使酵母重復(fù)使用，清酒罐中防止雜菌繁殖，還能用于大包裝啤酒的生物穩(wěn)定性處理；氧對啤酒風(fēng)味、穩(wěn)定性有較大危害。葡萄糖氧化酶是一種高效去氧復(fù)合酶，含有葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶和轉(zhuǎn)化酶，主要作用是除氧，能大幅度減少啤酒中溶解氧和瓶頸空間氧，最大限度消除啤酒中氧化味，延長啤酒保質(zhì)期。59（4）、展望：啤酒的主要原料是麥芽等，在拓寬啤酒行業(yè)原料使用的范圍上應(yīng)該有很多工作可以展開，比如，在非洲SABmiller公司充分利用當(dāng)?shù)馗吡蛔鲈?，開展酶制劑的應(yīng)用研究，由于高粱成分比較特殊，需要B-葡聚糖酶、木聚糖酶、戊聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶及多肽酶等組成。選育生產(chǎn)菌種的產(chǎn)毒（素）和致病性研究：產(chǎn)毒的量在一定范圍內(nèi)，不能使用致病菌。酶產(chǎn)品的毒理學(xué)研究：急性毒性，致突變性，30天喂養(yǎng)實驗等。生產(chǎn)的GMP和原輔料：生產(chǎn)過程符合GMP的要求，原輔料食品級。產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)：符合理化和衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。60第三節(jié)酶生物合成調(diào)節(jié)的基本理論一、酶的生物合成：酶在生物體內(nèi)產(chǎn)生的過程。（蛋白質(zhì)的生物合成）二、酶蛋白生物合成的調(diào)節(jié)1、酶生物合成的誘導(dǎo)作用2、酶合成的反饋阻遏作用3、分解代謝物的阻遏作用611、誘導(dǎo)作用（誘導(dǎo)酶）定義：加進(jìn)某種物質(zhì)，使酶的生物合成開始或加速進(jìn)行的過程。酶基質(zhì)基質(zhì)結(jié)構(gòu)類似物-半乳糖苷酶乳糖異丙基巰基-

-D-半乳糖苷

安慰性誘導(dǎo)物62酶基質(zhì)產(chǎn)物葡萄糖淀粉酶淀粉麥芽糖，異麥芽糖，葡萄糖

脂肪酶油脂脂肪酸纖維素酶纖維素葡萄糖63某些商業(yè)酶的誘導(dǎo)

酶底物誘導(dǎo)物α-淀粉酶淀粉淀粉或麥芽糊精葡萄糖淀粉酶（異淀粉酶）淀粉麥芽糖或異麥芽糖轉(zhuǎn)化酶蔗糖蔗糖普魯蘭酶普魯蘭普魯蘭或麥芽糖木糖異構(gòu)酶木糖木聚糖或木糖642、反饋阻遏作用定義：酶催化作用的產(chǎn)物或代謝途徑的未端產(chǎn)物使該酶的生物合成受阻的過程。途徑終點產(chǎn)物與細(xì)胞內(nèi)阻遏物蛋白結(jié)合，產(chǎn)生阻遏物，可關(guān)閉編碼酶的結(jié)構(gòu)基因，遏制酶的合成，這類酶叫可阻遏的酶①限制曲霉培養(yǎng)基中磷酸鹽濃度可增加核酸酶、磷酸酯酶、植酸酶的生產(chǎn)30到50倍。65②色氨酸的過量積累，對色氨酸合成途徑中的5種酶的生物合成均起反饋阻遏作用。E、D、C、B、A分別為鄰氨基苯甲酸合成酶、鄰氨基苯甲酸磷酸轉(zhuǎn)移酶，鄰氨基苯甲酸異構(gòu)酶，吲哚甘油-3-磷酸合成酶，色氨酸合成酸。分枝酸色氨酸66調(diào)節(jié)基因（R）啟動基因（P)操縱基因(O)673、分解代謝物阻遏定義：容易利用的碳源阻遏某些酶（主要是誘導(dǎo)酶）生物合成的現(xiàn)象。葡萄糖阻遏

－半乳糖苷酶的生物合成機理：葡萄糖的大量存在，降低了胞內(nèi)cAMP濃度①葡萄糖抑制腺苷酸環(huán)化酶活性，降低cAMP生成：ATP→cAMP+Pii；或②葡萄糖存在引起ATP濃度上升，消耗胞內(nèi)cAMP：cAMP+H2O→ADP→ATP），結(jié)果啟動子上沒有cAMP－CRP復(fù)合物結(jié)合，RNA聚合酶也就無法結(jié)合到啟動子的位點上。P啟動子包括兩個結(jié)合位點：RNA聚合酶結(jié)合位點，cAMP－CRP復(fù)合物結(jié)合位點68第四節(jié)酶的發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)酶的發(fā)酵生產(chǎn)：通過人工操作控制，利用細(xì)胞（包括微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞和動物細(xì)胞）的生命活動，產(chǎn)生人們所需要酶的過程。一、微生物發(fā)酵產(chǎn)酶方式1.固體培養(yǎng)定義：利用麩皮和米糠為主要原料，添加谷殼，豆餅等，加水拌成半固體狀態(tài)，供微生物生長和產(chǎn)酶用。適合來源于霉菌的酶制劑的生產(chǎn)，如米曲霉的α-淀粉酶、蛋白酶、乳糖酶；木酶的纖維素酶；黑曲霉的果膠酶等。產(chǎn)生的酶具有混合與酶活性強的特點。方法：淺盤法、轉(zhuǎn)桶法、厚層通氣法69淺盤法：將固態(tài)培養(yǎng)基平鋪在淺盤（多為木盤或竹匾）內(nèi)，厚約3-5厘米，在能夠控制濕度、溫度的曲房里進(jìn)行發(fā)酵。轉(zhuǎn)桶法：將固態(tài)培養(yǎng)基接入菌種后，放在可旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)桶內(nèi)，當(dāng)桶慢慢轉(zhuǎn)動時，培養(yǎng)基即在轉(zhuǎn)桶內(nèi)翻動，通氣及溫濕度調(diào)節(jié)較為均勻，有利于微生物的生長和產(chǎn)酶。厚層通氣法：將固體培養(yǎng)基接入菌種后，平鋪在具有多孔的大池內(nèi)，厚度可達(dá)20-30厘米；待微生物已開始生長，即從池底通入一定溫度和相對濕度的空氣，使微生物比較均勻適宜地生長繁殖和產(chǎn)酶。707172優(yōu)點：①設(shè)備簡單，投資較少。②環(huán)境污染少；③特別適用于霉菌的培養(yǎng)和發(fā)酵產(chǎn)酶。缺點：①勞動強度大；②原料利用率低；③產(chǎn)酶純度較差；提取精制較難；④傳質(zhì)傳熱效率低，發(fā)酵條件不易控制均勻，產(chǎn)酶不穩(wěn)定；⑤不宜胞內(nèi)酶生產(chǎn)（菌體分離難度大）732.液體深層發(fā)酵液體表面發(fā)酵，目前已不采用。液體深層通風(fēng)發(fā)酵，主要設(shè)備是一個具有攪拌槳葉和通氣系統(tǒng)的密閉容器。優(yōu)點：①產(chǎn)酶純度高，質(zhì)量穩(wěn)定；②較易控制發(fā)酵條件，有利于自動化控制；③機械化程度高，勞動強度??；設(shè)備利用率高。缺點：設(shè)備投資較大，能源消耗大。747576773.固定化細(xì)胞發(fā)酵優(yōu)點：①固定化細(xì)胞的密度大，反應(yīng)器生產(chǎn)強度大；②發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以連續(xù)使用較長時間，易于連續(xù)化，自動化生產(chǎn)；③可在高稀釋率的條件下連續(xù)發(fā)酵,提高設(shè)備利用率；④發(fā)酵液含菌體較少，利于產(chǎn)品分離。缺點：①不能強烈攪拌；②技術(shù)要求高，傳質(zhì)傳熱效果差（氧氣供給，溫度控制。培養(yǎng)基成分的控制）；理論研究階段；③只適用于胞外酶的生產(chǎn)；78二、發(fā)酵工藝條件及控制

1．酶的發(fā)酵生產(chǎn)要求①性能優(yōu)良菌種（產(chǎn)率，穩(wěn)定性，發(fā)酵周期，營養(yǎng)要求，副產(chǎn)物，安全性）②滿足菌種生長需求；③滿足菌種產(chǎn)酶需求。792．酶發(fā)酵生產(chǎn)的工藝流程保藏菌種

菌種活化

菌種擴(kuò)大培養(yǎng)

發(fā)酵

分離純化

酶803、培養(yǎng)基微生物酶生產(chǎn)的培養(yǎng)基微生物酶生產(chǎn)的培養(yǎng)基與其它發(fā)酵產(chǎn)品的培養(yǎng)基一樣，都包括碳源、氮源、無機鹽和生長因子。在酶制劑的生產(chǎn)過程中常加入產(chǎn)酶促進(jìn)劑，即加入少量的某種能顯著增加酶產(chǎn)量、作用并未闡明清楚的物質(zhì)。在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中，對于誘導(dǎo)酶來詳，在培養(yǎng)基中添加適量誘導(dǎo)物，也可使產(chǎn)酶量顯著提高。產(chǎn)酶誘導(dǎo)物通常是酶作用的底物或底物類似物，如常用的產(chǎn)酶促進(jìn)劑有吐溫-80、植酸鈣鎂、洗凈劑LS、聚乙烯醇、乙二胺四乙酸等。81培養(yǎng)基設(shè)計考慮：①菌種特性②不同培養(yǎng)階段③產(chǎn)物④原料來源難易。培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分：碳源：構(gòu)成菌體成分的元素，能量的來源。氮源：含氮物質(zhì)的如氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等的成分。無機鹽生長因子產(chǎn)酶促進(jìn)劑82幾種農(nóng)副產(chǎn)品和野生淀粉質(zhì)原料成分（近似%）

原料名稱

水分

粗淀粉

粗蛋白

粗脂肪

粗纖維

灰分

甘薯干

12.976.66.10.51.42.4玉

米

12.073.08.54.31.31.7麩

皮

12.155.413.53.810.44.8米

糠

11.538.516.018.57.05.5馬鈴薯

68.526.72.60.10.91.2木

薯

70.321.41.20.41.10.5土茯苓

10.852.52.7——11.52.3橡

子

11.055.05.7——————石蒜——40.04.5——0.99.7(2)碳源：83幾種常用有機氮源成分（近似%）

原料名稱

水分

粗淀粉

粗蛋白

粗脂肪

粗纖維

灰分

豆

餅

12.527.543.011.57.85.8花生餅

10.724.346.87.98.74.9菜籽餅

4.629.938.111.410.15.9棉籽餅

6.628.640.37.410.86.2常用無機氮源：硫酸銨、氯化銨、氨水84（4）無機鹽角色：蛋白質(zhì)（包括酶）和核酸的主要元素（參與細(xì)胞的組成，細(xì)胞能量代謝，調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的透性，酶的激活劑），并對培養(yǎng)基的pH，氧還電位，滲透壓起調(diào)節(jié)作用。主要元素：磷、硫、鉀、鎂、鈣、鈉、微量元素：鐵、銅、鋅、錳、鈷、85磷，特別重要的元素作用：構(gòu)成核酸和磷脂的成分；參與所有的能量轉(zhuǎn)移過程（ATP，GTP）；許多酶的組成成分。常用的補磷劑：KH2PO4，K2HPO4，Na2HPO4，(NH4)2HPO4，H3PO4微量元素：有的是某些酶組成成分，有的是酶的激活劑，有的是輔酶的必須成分。天然原料中常已存在，一般無須另外加入。86（5）生長因子定義：細(xì)胞生長繁殖不可缺少的微量有機化合物，如aa,Vit,嘌呤，嘧啶，激素提供生長素的天然原料：玉米漿(含生長素32-128mg/ml、豆芽汁、麥芽汁，酵母膏等。舉例：添加含有生長因子的大豆的酒精提取物，米曲霉的蛋白酶產(chǎn)生量提高2.9倍，金黃曲霉的脂肪酶產(chǎn)生量提高2.6倍87（6)產(chǎn)酶促進(jìn)劑定義：凡能顯著增加酶產(chǎn)量的某種少量物質(zhì)，主要為酶的誘導(dǎo)物或表面活性劑，酶的底物或底物類似物，誘導(dǎo)物的前體。纖維素酶生產(chǎn)中纖維二糖是誘導(dǎo)物。表面活性劑能增加酶的產(chǎn)量，土溫80，植酸鈣鎂、洗凈劑LS、聚乙烯醇、EDTA等。酶的誘導(dǎo)物：酶作用底物、酶反應(yīng)產(chǎn)物、酶的底物類 似物表面活性劑：①提高膜的通透性②對酶的失活有保護(hù)作用③消泡以提高氧傳遞系數(shù)88添加吐溫80（0.1%）對多種酶產(chǎn)量提高的倍數(shù)

酶

來源

酶產(chǎn)量提高倍數(shù)

纖維素酶

多種霉菌

20蔗糖酶

多種霉菌

16β-1,3葡聚糖酶

多種霉菌

10β-葡萄糖苷酶

多種霉菌

8木聚糖酶

多種霉菌

4淀粉酶

多種霉菌

4核苷酶

多種霉菌

5酯酶

多種霉菌

6右旋糖苷酶

繩狀青霉

2茁霉多糖酶

產(chǎn)氣氣桿菌

1.589三、發(fā)酵過程的控制1.發(fā)酵過程中的代謝變化與代謝變化有關(guān)的參數(shù)1）物理參數(shù)：溫度、壓力、攪拌轉(zhuǎn)速、攪拌功率、溶解氧等。2）化學(xué)參數(shù)：基質(zhì)濃度、pH值、酶活力。3）生物參數(shù)：菌體形態(tài)，菌體濃度等。生長代謝曲線1）菌體生長階段2）產(chǎn)酶階段3）菌體自溶階段90912.影響產(chǎn)酶的重要條件與細(xì)胞的生物繁殖以及發(fā)酵產(chǎn)酶有密切關(guān)系。①影響微生物體內(nèi)各種酶的活性，從而導(dǎo)致微生物的代謝途徑發(fā)生改變；②影響微生物形態(tài)和細(xì)胞膜的透性，從而影響微生物對培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌。③影響培養(yǎng)基中某些營養(yǎng)物質(zhì)的分解或中間代謝產(chǎn)物的解離，從而影響微生物對這些物質(zhì)的利用。（1）、pH值對酶生產(chǎn)的影響及控制92酶生產(chǎn)的適宜的pH值通常與酶反應(yīng)的最適pH值相接近。但酶反應(yīng)的最適pH值對某些酶來說可能是最不穩(wěn)定的。在這種情況下，酶反應(yīng)的最適pH值與酶生產(chǎn)的合適pH值差距就較大。如黑曲霉3350酸性蛋白酶反應(yīng)的最適宜pH值為2.5-3.0，而在pH6左右培養(yǎng)時酸性蛋白酶產(chǎn)量較高。細(xì)菌、放線菌6.5-8.0霉菌、酵母菌4.0-6.0植物細(xì)胞

5-6產(chǎn)酶最適pH：酸性蛋白酶4-6，中性蛋白酶6-7，堿性蛋白酶8.5-9；一般接近該酶反應(yīng)的最適pH93發(fā)酵過程中培養(yǎng)基pH的變化由菌種的特性、培養(yǎng)基組分、發(fā)酵條件等決定，引起pH變化的主要原因：微生物對培養(yǎng)營養(yǎng)成份的利用和代謝產(chǎn)物的積累。生理酸性物質(zhì)的生成或釋放，或生理堿性物質(zhì)的消耗導(dǎo)致發(fā)酵液pH下降。生理堿性物質(zhì)的生成或釋放，或生理酸性物質(zhì)的消耗導(dǎo)致發(fā)酵液pH上升。由于酶生產(chǎn)受培養(yǎng)基pH值的影響，故可利用培養(yǎng)基pH值來控制酶活性。例如利用黑曲霉生產(chǎn)糖化酶時，除糖化酶外還有α-淀粉酶和葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶的存在。當(dāng)pH值在中性時，糖化酶的活性高，其他兩種酶的活性低。其他兩種酶特別是葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶，因為它的存在嚴(yán)重影響葡萄糖吸收，在糖化酶生產(chǎn)時是必須除去的。因此將培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)到酸性就可以使這種酶的活性降低，如pH值達(dá)到2-2.5則有利于這種酶的消除。94培養(yǎng)基的pH值和碳氮比密切相關(guān)，因此微生物生產(chǎn)酶類的pH值也和碳氮比有關(guān)。例如米曲霉在碳氮比高的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，產(chǎn)酸較多，pH值下降，有利于酸性蛋白酶的生成；在碳氮比低的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，則pH值升高，有利于中性和堿性蛋白酶生成。由此可見，在酶生產(chǎn)過程中通過培養(yǎng)基的碳氮比來控制pH值，從而控制酶產(chǎn)量是很重要的。酶生產(chǎn)的pH值控制，一般根據(jù)酶生產(chǎn)所需求的pH值確定培養(yǎng)基的碳氮比和初始pH值，在一定通氣攪拌條件的配合下，使培養(yǎng)過程的pH值變化適合酶生產(chǎn)的要求。但是，也有在培養(yǎng)基中添加緩沖劑使其具有緩沖能力以維持一定pH值的；也有在培養(yǎng)過程中當(dāng)培養(yǎng)液pH值過高時添加糖或淀粉來調(diào)節(jié)，pH值過低時用通氨或加大通氣量來調(diào)節(jié)的。此外，也有用補料來控制培養(yǎng)基的碳氮比和pH值。95pH控制①初級調(diào)節(jié)控制（起始培養(yǎng)基）調(diào)整C/N，調(diào)整生理酸性物質(zhì)與生理堿性物質(zhì)之比。②補料調(diào)節(jié)：流加酸/堿，初加碳、氮源③溶解氧調(diào)節(jié)：控制代謝中間產(chǎn)物的氧化程度。④維持一定的pH值，添加緩沖液96（2）、溫度溫度是影響細(xì)胞生長繁殖和發(fā)酵產(chǎn)酶的重要因素之一。酶發(fā)酵培養(yǎng)溫度隨菌種不同而不同。細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適溫度與最適生長溫度亦不同。1最適生長溫度：枯草桿菌34-37℃，黑曲霉28-32℃，植物細(xì)胞25℃2最適產(chǎn)酶溫度低于最適生長溫度，在較低溫度下，提高酶的穩(wěn)定性，延長細(xì)胞產(chǎn)酶時間。3有些酶的發(fā)酵生產(chǎn)，要在不同階段控制不同溫度條件。在產(chǎn)酶過程中，為了有利于菌體的生長和酶的合成，可采用階段控制溫度，即在生長期，控制生長的最適溫度，在酶的合成期采用生產(chǎn)的最適溫度。但由于微生物合成酶的模式不同，應(yīng)根據(jù)合成模式，來控制適宜的溫度。97一般在較低的溫度條件下，可提高酶的穩(wěn)定性，延長細(xì)胞產(chǎn)酶時間。例如，用醬油曲霉生產(chǎn)蛋白酶，在28℃條件下發(fā)酵，蛋白酶產(chǎn)量比在40℃條件下高2-4倍；在20℃條件下發(fā)酵，蛋白酶的產(chǎn)量會更高。但并不是溫度越低越好，若溫度過時低，氧化反應(yīng)速度很慢，反而降低酶的產(chǎn)量，延長發(fā)酵同期，故必須進(jìn)行試驗，以確定最佳產(chǎn)酶溫度。酶生產(chǎn)的培養(yǎng)溫度隨菌種不同而不同，同一種微生物，在不同溫度下，可產(chǎn)生不同的酶，同一種酶也可由不同的微生物產(chǎn)生。例如利用芽孢桿菌生產(chǎn)蛋白酶，常采用30-37℃，而霉菌、放線菌的蛋白酶生產(chǎn)以28-30℃為佳。在20℃生長的低溫細(xì)菌，在低溫下形成蛋白酶最多。嗜熱微生物在50℃左右蛋白酶產(chǎn)量最大。98例：用枯草芽胞桿菌AS1.3398生產(chǎn)中性蛋白酶，采用變溫發(fā)酵培養(yǎng)溫度必須從30℃逐漸升溫至40℃，然后再降溫至31℃進(jìn)行培養(yǎng)，蛋白酶產(chǎn)量比不變溫高66％溫度控制發(fā)酵時間發(fā)酵單位變溫0-4h30-30℃4-8h32-40℃(2℃/h↑)26.57100u/ml8-12h40-32℃(2℃/h↓)12h后30-32℃恒溫30-32℃27h4275u/ml99（3）、溶解氧對酶生產(chǎn)的影響酶生產(chǎn)所用的菌體一般都是需氧微生物，培養(yǎng)時都需要通風(fēng)攪拌，但培養(yǎng)基中溶氧的濃度因菌種而異。一般，通氣量少對霉菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長有利，對酶生產(chǎn)不利。例如米曲霉的淀粉酶生產(chǎn)，培養(yǎng)前期降低通氣量則促進(jìn)菌體生長而酶產(chǎn)量減少；通氣量大則促進(jìn)產(chǎn)酶而對菌體生長不利。又如，以棲土曲霉生產(chǎn)中性蛋白酶，風(fēng)量大時菌絲生長較差，但酶產(chǎn)量是風(fēng)量大時的7倍。然而并不是利用曲霉進(jìn)行酶生產(chǎn)時產(chǎn)酶期的需氧量都比菌體生長期大，也有氧濃度過大而抑制酶生產(chǎn)的現(xiàn)象。例如黑曲霉的淀粉酶生產(chǎn)，酶生產(chǎn)時的需氧量為生長旺盛時菌的需氧量的30-40％。100利用細(xì)菌進(jìn)行酶生產(chǎn)時，一般培養(yǎng)后期的通氣攪拌程度比前期劇烈，但也有例外的情況，例如枯草桿菌的α-淀粉酶生產(chǎn)，在對數(shù)生長期末降低通氣量可促進(jìn)α-淀粉酶生產(chǎn)。據(jù)報道，利用霉菌進(jìn)行固體培養(yǎng)生產(chǎn)蛋白酶時，CO2對孢子萌發(fā)與產(chǎn)酶有作用，而不利于生長，因此在孢子發(fā)芽與產(chǎn)酶時通入的空氣中摻入CO2有利于提高酶產(chǎn)量。在枯草桿菌的α-淀粉酶生產(chǎn)中，CO2對細(xì)胞繁殖與產(chǎn)酶均有影響，當(dāng)通入的空氣中含CO28％時，α-淀粉酶活性比對照提高3倍。101調(diào)節(jié)溶氧速率的方法：①調(diào)節(jié)通氣量。②調(diào)節(jié)氧的分壓：富氧增加空氣壓力。③調(diào)節(jié)氣液接觸時間：增加液位高度，增設(shè)檔板。④調(diào)節(jié)氣液接觸面積：提高攪拌速率，空氣分布管及其直徑⑤培養(yǎng)液的特性：粘度、表面張力、菌體濃度，離子濃度。如培養(yǎng)液粘度高，通氣攪拌也要加強，以利于提高溶氧。102（4）、泡沫

1酶制劑發(fā)酵過程中產(chǎn)生的泡沫較多，產(chǎn)生原因：強烈的通氣攪拌和培養(yǎng)基中天然蛋白質(zhì)原料含量較高。2造成危害：①阻礙CO2的排除，影響氧的溶解；②溢罐，導(dǎo)致浪費原料，引起染菌；③裝液量減少，降低發(fā)酵罐的利用率。3采取措施：①減少泡沫形成（原料，罐壓，攪拌）②機械消泡與化學(xué)消泡。消泡劑：天然油脂；高碳醇脂肪酸和酯；聚醚；硅酮。103（5）、發(fā)酵過程的中間補料補料方案：①補糖(碳源)②補氮源③補無機鹽和產(chǎn)酶促進(jìn)劑④補全料和補水。-淀粉酶：用3倍濃度碳源的培養(yǎng)基補料，體積相當(dāng)于基礎(chǔ)料的1/2；從培養(yǎng)12h開始，每小時1次，分30余次添加完畢。糖化酶：補氨水，C、N源總濃度30-35%酶活25000-30000U/ml104（1）、添加誘導(dǎo)物:對于誘導(dǎo)酶的發(fā)酵生產(chǎn)，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)物能使酶的產(chǎn)量顯著增加。一般可分為三類：①酶的作用底物②酶的反應(yīng)產(chǎn)物③酶的底物類似物3、提高酶產(chǎn)量的措施

（2）降低阻遏物濃度微生物酶的生產(chǎn)受到代謝末端產(chǎn)物的阻遏和分解代謝物阻遏的調(diào)節(jié)。為避免分解代謝物的阻遏作用，可采用難于利用的碳源，或采用分次添加碳源的方法使培養(yǎng)基中的碳源保持在不致于引起分解代謝物阻遏的濃度。1053、表面活性劑：改變細(xì)胞的通透性4、添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑:產(chǎn)酶促進(jìn)劑是指可以促進(jìn)產(chǎn)酶、但作用機理并未闡明清楚的物質(zhì)。添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑往往對提高酶產(chǎn)量有顯著效果。例如添加植酸鈣可使多種霉菌的蛋白酶和橘青霉的5'5'--磷酸二酯酶的產(chǎn)量提高2-20倍。106第五節(jié)酶發(fā)酵動力學(xué)酶發(fā)酵動力學(xué)：研究發(fā)酵過程中速率及其影響因素的科學(xué)。包括細(xì)胞生長動力學(xué)、反應(yīng)基質(zhì)消耗動力學(xué)和酶生成動力學(xué)等。107一．微生物細(xì)胞生長與產(chǎn)酶的關(guān)系產(chǎn)酶細(xì)胞在一定條件下進(jìn)行培養(yǎng),其生長過程要經(jīng)歷調(diào)整期、對數(shù)生長期、平衡期和衰退期四個階段。通過分析酶產(chǎn)生與細(xì)胞生長的關(guān)系，可以把酶的生物合成模式分為以下四種類型1081091、同步合成型：酶的合成與生長同步進(jìn)行。酶的生物合成可以誘導(dǎo)，但不受分解代謝物阻遏和反應(yīng)產(chǎn)物阻遏。去除誘導(dǎo)物或細(xì)胞進(jìn)入平衡期后，酶的合成立即停止。酶的合成與細(xì)胞生長同步進(jìn)行，細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期，酶大量產(chǎn)生，細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期后酶的合成隨著停止表明這類酶所對應(yīng)的mRNA很不穩(wěn)定。米曲霉可由單寧誘導(dǎo)生成鞣酸酶（單寧酶）dP/dt=α·dX/dtqP=α·μqP：產(chǎn)物比生產(chǎn)速率α：產(chǎn)物得率(g產(chǎn)物/g菌體）μ：菌體比生產(chǎn)速率(h-11102、延續(xù)合成型酶的合成伴隨著細(xì)胞的生長而開始，但在細(xì)胞生長進(jìn)入穩(wěn)定期后，酶還可以延續(xù)合成較長的一段時間。該類酶的生物合成可以誘導(dǎo)，但不受分解代謝物和反應(yīng)產(chǎn)物阻遏。這類酶所對應(yīng)的mRNA相當(dāng)穩(wěn)定，在生長穩(wěn)定期以后相當(dāng)長的一段時間內(nèi)繼續(xù)用于酶的合成。在細(xì)胞生長期和平衡期均可產(chǎn)生酶，是部分生長偶聯(lián)型.黑曲酶生產(chǎn)β-半乳醛酸酶，經(jīng)純果膠為誘導(dǎo)物時酶的合成為延續(xù)合成型dP/dt=α·dX/dt＋β·XqP=α·μ＋ββ：與菌體生長非相關(guān)的產(chǎn)物比生成速率（g產(chǎn)物/g細(xì)胞.h)1113、中期合成型酶合成在細(xì)胞生長一段時間以后才開始，而在細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定期后，酶的合成也隨著停止。酶的合成特點：為特殊的生長偶聯(lián)型，其產(chǎn)酶動力學(xué)方程與同步合成型相同，然而，在有阻遏物存在時，α＝0，無酶產(chǎn)生，在解除阻遏后，才開始酶的合成。受反饋阻遏，而且其所對應(yīng)的mRNA不穩(wěn)定。

枯草桿菌合成堿性磷酸酶