一種基于線粒體12srrna基因序列的烏梢蛇鑒別方法

一種基于線粒體12srrna基因序列的烏梢蛇鑒別方法

兔子是《中國藥典》（2005年版）中常用的一種中藥，來自老虎科動物的烏梢蛇。有祛風(fēng)、通絡(luò)、止痙之功效。用于風(fēng)濕頑痹、麻木拘攣、半身不遂、抽搐痙攣、瘰癘惡瘡。鑒于烏梢蛇作為中藥的臨床功效確切,但商品來源復(fù)雜、藥材性狀鑒別困難的現(xiàn)狀,我們對市場上烏梢蛇藥材流通情況進行了調(diào)查。商品流通中多以紅點錦蛇[Elapherufodorsata(Cantor)]、黑眉錦蛇[Elaphetaeniura(Cope)]、玉斑錦蛇[Elaphemandarinus(Cantor)]、王錦蛇[Elaphecarinata(Guenther)]、灰鼠蛇[Ptyaskorros(Schlegel)]等來混作正品藥材進行銷售,這些品種多數(shù)與烏梢蛇同科不同屬,因其來源相近,造成鑒定困難。此外,藥材在加工處理時剖去內(nèi)臟后,要進行干燥熏黑處理,皮上的花紋特征、顏色幾近消失,難以辨認(rèn),而且其大小、形態(tài)特征與烏梢蛇相近,這是造成其性狀鑒別困難的另一重要原因。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展,利用DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)鑒別中藥材的真?zhèn)我殉蔀榭赡?。王義權(quán)等通過對烏梢蛇及其混淆品線粒體Cytb基因進行測序,通過對測序結(jié)果的比對分析來鑒別烏梢蛇的真?zhèn)?但因?qū)NA進行測序成本較高,操作有難度,不同人的測序結(jié)果會存在偏差,所以在實際應(yīng)用中適用性不強。為了深入烏梢蛇類藥材分子遺傳標(biāo)記鑒別研究,滿足目前市場常見混偽品的鑒別要求,尋找更為經(jīng)濟實用、準(zhǔn)確便捷、穩(wěn)定性高的方法,本實驗用高特異性PCR方法對烏梢蛇藥材及其混淆品的原動物和炮制品進行鑒別。1材料和方法1.1材料表面用于高特異性PCR鑒別方法學(xué)研究的實驗材料見表1。烏梢蛇炮制品購自北京同仁堂、北京京隆堂、北京陽光同仁藥房、北京金象大藥房。1.2烏梢蛇12srrna擴增引物和hwl-1和hwh-1引物的設(shè)計從GenBank下載正品原動物烏梢蛇及混偽品黑眉錦蛇、紅點錦蛇、灰鼠蛇、眼鏡蛇、赤鏈蛇、玉斑錦蛇、赤鏈華游蛇、王錦蛇、滑鼠蛇、原動物線粒體12SrRNA基因序列(GenBank登錄號依次為:AF236676,AF233940,AF236675,AF236680,AF236683,AF233939,AF236670,AF236677,AF236674,AY122828),經(jīng)DNAMAN軟件對位排列分析正、混品間DNA序列差異,設(shè)計出一對能特異性擴增烏梢蛇12SrRNA基因片段的特異性鑒別引物HWL-1和HWH-1(上海生工生物公司合成)。烏梢蛇及其混淆品12SrRNA序列(約800bp)的部分序列,見表2。1.3模型dna提取取烏梢蛇及混淆品原動物和炮制品(醋炙烏梢蛇段)的干燥肌肉組織約1g,參照王義權(quán)等方法提取DNA模板。1.4pcr擴增條件PCR反應(yīng)體系25μL,其中10mmol·L-1Tris-HCl(pH8.3),50mmol·L-1氯化鉀,Mg2+1.5mmol·L-1,dNTP各0.15μmol·L-1,Taq1U(TakaraExTaq),引物各0.15μmol·L-1,模板DNA50ng。循環(huán)參數(shù):95℃預(yù)變性4min;95℃變性40s,55～65℃復(fù)性1min,72℃延伸30s;25個循環(huán);72℃延伸5min。PCR反應(yīng)選用不同的復(fù)性溫度以尋找合適的PCR鑒別反應(yīng)參數(shù)。實驗中設(shè)置無DNA模板的陰性對照。取5μL反應(yīng)液經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色,紫外凝膠分析檢測,成像。同時用擴增約400bp的12SrRNA基因片段的通用引物(L10915′AAACTGGGATTAGATAC-CCCACTAT3′和H14785′TGACTGCAGAGGGTGACGGGCGGTGTGT3′)在55℃的復(fù)性溫度下對上述用于PCR鑒別的模板DNA作陽性擴增對照。2結(jié)果2.1pcr檢測dna質(zhì)量烏梢蛇藥材及混淆品原動物和炮制品(醋炙烏梢蛇段)提取的DNA模板用通用引物L(fēng)1091和H1478擴增,得到約400bp擴增帶(圖1),表明樣品中模板DNA質(zhì)量符合PCR反應(yīng)的要求。2.2烏梢蛇、赤鏈蛇同時擴增帶的選擇用鑒別引物PCR擴增烏梢蛇原動物樣品的DNA,當(dāng)復(fù)性溫度為55℃時,烏梢蛇的正品有兩條帶,玉斑錦蛇、紅點錦蛇、三索錦蛇有1條很弱的帶(圖2A);當(dāng)復(fù)性溫度為60℃,烏梢蛇、赤鏈蛇同時擴增出一條帶(圖2B);當(dāng)復(fù)性溫度升至65℃,25個循環(huán)時,其反應(yīng)具有高度特異性,僅正品烏梢蛇有良好的單一擴增帶,其余樣品皆無擴增帶出現(xiàn)。當(dāng)退火和延伸溫度合并為68℃時,正品也未見擴增帶出現(xiàn)。故特異性PCR循環(huán)參數(shù)確定為:95℃預(yù)變性4min;95℃變性40s,65℃復(fù)性1min,72℃延伸30s,25個循環(huán);72℃延伸5min。因此,依據(jù)鑒別引物擴增模板DNA有無擴增條帶即可確定受試樣品是否為正品(圖3)。2.3烏梢蛇不同來源小鼠體內(nèi)dna的pcr鑒定結(jié)果因物種種內(nèi)存在變異,本次實驗針對動物類藥材不同產(chǎn)地間物種的變異是否會影響PCR特異性鑒別結(jié)果進行了驗證。將所有收集到的烏梢蛇正品及混淆品原動物的DNA模板進行PCR鑒別,結(jié)果顯示不同來源的4個正品烏梢蛇在320bp處出現(xiàn)擴增帶,而混淆品均未見擴增帶(圖3B)。表明烏梢蛇及其混淆品同一物種的種內(nèi)差異不會影響高特異性PCR鑒別的結(jié)果。2.4烏梢蛇的鑒定用烏梢蛇鑒別引物,對北京同仁堂、京隆堂、陽光同仁藥房、金象大藥房隨機購買的烏梢蛇藥材炮制品進行PCR鑒別,結(jié)果顯示,樣品1,2,3,4,6,8,11,12,13在約320bp處出現(xiàn)一條明亮的擴增帶,表明為正品烏梢蛇;而樣品5,7,9,10均無擴增帶出現(xiàn),表明是烏梢蛇的混淆品(圖4)。本結(jié)果與根據(jù)藥材外觀性狀、顯微鑒別的鑒定結(jié)果完全一致。1～4-BeijingTongrentang;5～7-BeijingJinglongtang;8-10-BeijingYangguangtongrenyaofang;11～13-BeijingJinxiangyaofang;N-negativecontrolwithoutDNAtemplate;M-DNAmarker3討論3.1混淆品的種類文獻報道的烏梢蛇混淆品達二三十種,不同文獻報道的種類也存在較大差異,本次研究未能包括所有文獻報道的混淆品。實際調(diào)查中發(fā)現(xiàn),有些混淆品在商品流通中出現(xiàn)的頻率極低,另一些則由于來源于非游蛇科,在外觀上其形態(tài)、大小與烏梢蛇相差很遠,通過性狀特征容易區(qū)別開。所以本課題組尋找市場上充偽頻率高、來源相近、外觀形態(tài)上與烏梢蛇相近的品種,進行了PCR鑒別研究,這才具有重要意義。3.2烏梢蛇類藥材的鑒定市售的烏梢蛇藥材部分是經(jīng)過醋炙的烏梢蛇段,失去個體的完整性,更利于不法商販進行制假、摻假,以大量的混淆品來充當(dāng)正品烏梢蛇。由于藥材在醋炙過程中外觀形態(tài)、皮和骨骼等會發(fā)生不同程度的改變,所以給烏梢蛇藥材性狀鑒別帶來了更大的困難。而本研究顯示,用DNA分子標(biāo)記鑒別則能夠更好地克服這個弊端,對烏梢蛇類藥材的炮制品在DNA水平上進行準(zhǔn)確鑒定。如將這對特異性引物加入Taq試劑盒配成鑒別試劑盒,PCR時只需加入模板和引物,反應(yīng)完成后即可直接電泳,使鑒別反應(yīng)更加簡化、便捷;供各級藥檢所用來鑒定藥材及其炮制品,具有很大的應(yīng)用價值。真正體現(xiàn)出了藥材分子鑒別快速、準(zhǔn)確可靠、易于操作的優(yōu)點。3.3烏梢蛇種的選擇