蘑菇毒素的研究與應(yīng)用

蘑菇毒素的研究與應(yīng)用

蘑菇毒素的研究始于20世紀(jì)60年代，是對著名有毒雞膏的研究開始的。到了20世紀(jì)50年代已經(jīng)分離、純化、鑒定出鵝膏毒肽(amatoxins)、鬼筆毒肽(phallotoxins)和毒傘素(virotoxins)等,因而有人獲得了1927年和1964年的諾貝爾化學(xué)、生理學(xué)獎,引起世人矚目。研究表明,蘑菇毒素具有特殊的生物活性,如對癌細胞的殺傷力等,人們期望能夠通過對它的毒性成分、藥理學(xué)研究尋找到一種理想的藥物,使之成為治病良藥,這是當(dāng)前擺在菌物學(xué)和藥物學(xué)工作者面前的一項重要研究課題。有關(guān)毒蘑菇方面已有許多出色的論述。本文對主要蘑菇的毒性成分、中毒機理以及應(yīng)用前景進行了概述。1主要毒蘑菇及其毒性成分和中毒機制1.1毒蠅充堿melo-4-5毒蠅鵝膏又稱毒蠅傘、捕蠅菌、蟾斑紅毒傘、蛤蟆菌。分布于吉林、遼寧、黑龍江和四川等省。該菌屬神經(jīng)毒類,食后異常興奮并產(chǎn)生幻覺,古代歐洲人把它用做參戰(zhàn)士兵的興奮劑和藥酒,或用于狂歡節(jié)上。最初的成分報告見于1869年,但真正分離提純出毒蠅堿(muscarine)是到了1954年由瑞士人C.H.Eugster完成的。當(dāng)時他利用1250kg蘑菇子實體得出純毒蠅堿3～4g(含量0.0003%),并鑒定出許多異構(gòu)體(見圖1)。其中,L-(+)-(2S,3R′,5S)-毒蠅堿(muscarine)的毒性最大,通過對小白鼠的毒理實驗得知LD50為0.23mg/kg。另外,毒蠅鵝膏中還含有異鵝膏胺(muscimol)、鵝膏氨酸(ibotenicacid)和異鵝膏氨酸(muscazone)等。1958年日本北海道大學(xué)松本氏等曾選擇性地進行人工合成毒蠅堿,并利用離體青蛙心跳運動的增減實驗得到證明。在黃色(var.formosa)和白色(var.alba)變種中isoxazole類毒性成分基本沒有變化,為0.17%～0.18%,但夏季采樣含量較高,有人指出長時間的干燥保存會導(dǎo)致毒性喪失。毒蠅堿可溶于水,毒性極強。由于它刺激副交感神經(jīng),引起心跳減慢減弱,加強腺體分泌,增強胃腸蠕動,發(fā)生平滑肌痙攣,瞳孔縮小,對中樞神經(jīng)也有異常興奮作用。因此,食后常表現(xiàn)為興奮、產(chǎn)生幻覺、流汗、流涎、流淚,肺部水腫而呼吸困難,昏迷甚至死亡。Muscarine除了在Amanitamuscaria和A.pantherina中有分布外,在鵝膏科以外的類群中也有報道,如在絲膜菌科的絲蓋傘屬(Inocybe),口蘑科的離褶傘屬(Lyophyllum)、杯傘屬(Clitocybe)、小菇屬(Mycena)中均有一定的含量。例如有人報道在叢生離褶傘(Lyophyllumconnatum)中含0.012%,Clitocybegibba中含0.01%～0.18%,C.illudens中含0.0075%,C.rirulosa中含0.035%。1.2藥物和體外制劑毒鵝膏也叫毒傘、綠帽菌、蒜葉菌、鬼筆鵝膏。分布于吉林、黑龍江、江蘇、安徽、福建、廣東、廣西。據(jù)報道,在歐洲毒蘑菇中毒事件中有90%～95%是由于誤食此菌而造成的,僅1個子實體就足以使人致死。本世紀(jì)30年代開始,Th.Wieland等人對它的環(huán)肽毒性成分進行了分析研究,根據(jù)其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)可分為鵝膏毒肽(amatoxins)、鬼筆毒肽(phallotoxins)2種,其中前者為一類雙環(huán)八肽,毒性比后者強10～20倍。有趣的是該屬另一可食種Amanitarubescens中也含有phallotoxins,動物實驗證明:鵝膏毒肽為毒鵝膏的主要毒性物質(zhì),小白鼠LD50為0.2～0.5mg/kg。目前已被純化分離鑒定的天然產(chǎn)物有α-鵝膏毒肽(α-amanitin)、β-鵝膏毒肽(β-amanitin)、γ-鵝膏毒肽(γ-amanitin)、ε-鵝膏毒肽(ε-amanitin)、三羥鵝膏毒肽酰胺(amaninamide)、一羥鵝膏毒素酰胺(amanullin)、一羥鵝膏毒肽羧酸(amanullinicacid)、羧基鵝膏毒肽酰胺原(proamanullin)和三羥基鵝膏毒肽(amanin)等9種(見圖2),屬于慢性毒素,一般中毒后9～12d死亡。近年來,用人工合成的方法得到了40種以上的衍生物,并了解到S==OS=Ο的有無和環(huán)肽的結(jié)構(gòu)及其整個空間結(jié)構(gòu)的變化均可影響其毒性。張志光等(1998,私人通訊)利用分布于我國湖南的灰花紋鵝膏(Amanitafuliginea)為材料,分析結(jié)果為主要毒性成分α-amanitin(6788.3μg/g)和β-amanitin(2633.8μg/g)的含量均比歐洲的毒鵝膏所含α-amanitin(1757μg/g)和β-amanitin(1607μg/g)高出1～3倍。鬼筆毒肽是一類雙環(huán)七肽,天然產(chǎn)物有二羥鬼筆毒肽(phalloidin)、一羥鬼筆毒肽(phalloin)、一羥鬼筆毒肽原(prophalloin)、三羥鬼筆毒肽(phallisin)、羧基三羥鬼筆毒肽(phallacin)、羧基二羥鬼筆毒肽(phallacidin)、羧基一羥鬼筆毒肽(phallisacin)等7種,屬于速效毒素。LD50為1.5～4.0mg/kg。amatoxins和phallotoxins在子實體的不同部位中的含量也不同。關(guān)于amatoxins和phallotoxins的毒性機理,目前已有定論。Fiume等多年研究發(fā)現(xiàn)amanitin中毒的小白鼠肝細胞核仁碎裂,并且細胞核中的RNA含量持續(xù)減少。進一步的研究證明,體內(nèi)或體外由amanitin處理的鼠肝細胞核的RNA合成被嚴(yán)重阻斷,因此認為amanitin具有抑制RNA聚合酶的活性,從而阻礙了蛋白質(zhì)的合成。給實驗動物少量phallotoxins后可立即引起肝臟肥大,造成明顯的機能性障礙。Phallotoxins與細胞中的肌絲蛋白(F-actin)進行專一性的相結(jié)合,極大地穩(wěn)定了F-actin的結(jié)構(gòu),促使了肌球蛋白(G-actin)的聚合,從而打破了F-action與G-actin的動態(tài)平衡狀態(tài)。張志光等用amatoxins和pahllotoxins的粗毒液處理綠豆種子,強烈抑制其下胚軸生長和蛋白質(zhì)合成。該菌屬于肝損傷型。食后潛伏期較長,一般為6～12h,初期癥狀為惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉,隨后呼吸困難、面肌抽搐、肌肉痙攣,肝、腎細胞嚴(yán)重損壞,肝肥大或萎縮,昏迷致死。在本屬另一種劇毒蘑菇白毒傘A.virosa中,Th.Wieland(1980)分離得到稱為毒傘素(virotoxins)的一群化合物,共6種(圖3)。其結(jié)構(gòu)與phllotoxins相近,毒性機理也類似。據(jù)報道,鵝膏科以外的種類如盔孢菌Galerinafasciculata、秋盔孢菌G.autummnalis、褐鱗環(huán)柄菇Lepiotahelveola等中也含有上述毒性成分。1.3月夜菌LampteromycesjaponicusKawam.Sing.月夜菌又名毒側(cè)耳、日本側(cè)耳、日本亮耳菌。分布于我國東北和日本。外形、顏色上接近香菇(Lentinulaedodes)而易被人誤食。中毒屬胃腸型。有人從中分離出分子量為264的3種毒性成分illudineS,isoilludineS和dihydrolludineS,并用X線衍射法鑒定出其空間結(jié)構(gòu)。其中,成分(1)具有較強的抗癌活性,可醫(yī)治小白鼠的Ehrlich腹水癌。但是,它的毒性也很厲害,如在12h內(nèi)投0.6mg的量即可使小鼠致死。LD50為50mg/kg。由于毒性過強而目前尚未制成藥物。成分(2)和(3)是成分(1)的衍生物,成分(2)既沒有毒性也沒有抗癌活性,成分(3)雖沒有抗癌活性,但被認為是和菌體發(fā)光有關(guān)的物質(zhì)。后來又發(fā)現(xiàn)了illudinM成分,并于1968年對這類物質(zhì)進行研究,毒性機理不詳,人工合成如下。1.4鬼傘素的毒性成分墨汁鬼傘俗名柳樹鉆、雞腿蘑。在歐美被稱做Inkycap的鬼傘是一類特殊的蘑菇類群。單獨食用并不引起中毒,但在食用時或在食用后的2～3d之內(nèi)飲酒即可引起臉部紅腫,心率上升,頭暈、惡心、嘔吐,并出現(xiàn)呼吸困難等現(xiàn)象。癥狀同酒精中毒時服用的四乙基硫代尿咪disulfiram(antabuse)一樣,其毒性成分鬼傘素(coprine)首先由美國人Hatfield等(1936)分離得出,收率是160mg/kg。進一步的試驗證明,鬼傘素的體內(nèi)水解產(chǎn)物1-aminocyclopropanal為主要毒性物質(zhì),它對雄性實驗動物的生殖細胞帶來直接的影響,可減少精原細胞和精巢的重量。鬼傘素的結(jié)構(gòu)式為:從毒性機理上講,雖然鬼傘中從未分離出disulfiram,但對它的作用現(xiàn)有所了解,主要是由乙醛氧化為醋酸鹽時阻礙乙醛脫氫酶的作用,從而增加了血液中的乙醛濃度所引起的。除了墨汁鬼傘外,同屬的其它種類如晶粒鬼傘(C.micaceus)、毛頭鬼傘(C.comatus)和口蘑科的油口蘑(Tricholomaflavovirens)、棒柄杯傘(Clitocybeclavipes),球蓋菇科的翹鱗傘(Pholiotasquarrosa),牛肝菌科的褐黃牛肝菌(Boletusluridus)等也是“有條件的食用菌”,易引起disulfiram式中毒。1.5致幻藥物的成分為廣泛分布于各地的一種腐生菌。誤食后引起神經(jīng)精神型中毒癥狀,如醉酒一般,手舞足蹈,行動不穩(wěn),狂笑或產(chǎn)生幻覺,重者死亡。古代墨西哥土族人在宗教儀式上常食用當(dāng)?shù)氐囊恍┬⌒蛡憔_到“神仙”般的夢幻感覺。經(jīng)Wasson夫婦和Heim、Singer等真菌學(xué)家們實地考察發(fā)現(xiàn)他們所用的是球蓋菇屬(Stropharia)、光蓋菇屬(Psilocybe)和錐蓋傘屬(Conocybe)的20多種小型蘑菇。后來瑞士的Hofman等人(1958)的分析結(jié)果得知,這些蘑菇中含有與LSD(Lysergicaciddiethylamide,一種致幻劑,非菌類產(chǎn)物)相似的成分光蓋傘素-二甲-4-羥色胺(psilocybin)及其水解產(chǎn)物光蓋傘辛-二甲-4-羥色胺(psilocin),含量分別為0.2%～0.46%和0.005%(依產(chǎn)地、季節(jié)而有所變化)。據(jù)研究報告,在裸傘中也含有上述2種物質(zhì)。人服用4～8mg的psilocybin(相當(dāng)于干子實體2g)即可產(chǎn)生幻覺,如服用量增至5～15mg時就伴隨痛感乃至發(fā)生中毒癥狀。有人認為桔黃裸傘的毒性與它的苦味成分有關(guān),并分析、鑒定出其苦味成分gymnopilinA和B:最近,Kusano,G等從桔黃裸傘中分離得出另一種毒性(致幻)成分cerevisterol。食用致幻蘑菇所出現(xiàn)的癥狀較為復(fù)雜,產(chǎn)生異常的錯覺、幻覺、妄想等等。因為實驗動物很難再現(xiàn)這些感覺,所以對它的作用機理與應(yīng)用方面的研究較為滯后。目前一般認為,毒性物質(zhì)與LSD類似作用于中樞神經(jīng)至脊髓,從而導(dǎo)致交感神經(jīng)和生理機能的變化。在阿根廷光蓋傘(Psilocybeargentipes)、P.subcaerulipes、P.coprophila、P.fasciata、P.merdaria、碟形斑褶菇(Panaeoluspapilionaceus)、P.subbalteatus、P.semiovatus、安地拉斑褶菇(P.antillarum)、緊縮斑褶菇(P.sphinctrinum)、條緣裸傘(Gymnopilusliquiritiae)、綠褐裸傘(Gymnopilusaeruginosus)、黃蓋小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)、Agrocybefarinacea等蘑菇的子實體或菌絲中也測到致幻物質(zhì)psillocybin。1.6鹿花菌素的毒性此菌因地區(qū)差異也有食用者,一般認為用開水泡可拔毒。但在歐洲中毒死亡率為14.5%～34.5%,僅荷蘭自1953～1962年的10年間,在138名中毒患者中竟然有100人經(jīng)治療后仍死去。是否Gyromitra的所有種都含有毒素gyromitorin與此相接近的類群,如馬鞍菌屬(Helvella)、鐘菌屬(Verpa)、羊肚菌屬(Morchella)、盤菌屬(Peziza)等生食或熟食均有中毒報告。鹿花菌的毒素是由Boochm和Kueiz(1885)開始研究的,當(dāng)時被命名為馬鞍菌酸(Helvelicacid)。后來Fries等進行了結(jié)構(gòu)鑒定,發(fā)現(xiàn)口服它的提取物有中毒癥狀,而水合物則無毒性。1967年化學(xué)結(jié)構(gòu)式終于被確定,并命名為鹿花菌素(gyromitorin),研究指出鹿花菌素的水解產(chǎn)物甲基聯(lián)胺(mnomethylhydrazine,MMH)為主要毒性物質(zhì):MMH對粘膜的刺激性大,通過皮膚也能吸收。狗、猴等動物腹腔內(nèi)給予后24h內(nèi)其30%即可通過尿排出體外。對小白鼠的肝、胃、腸、膀胱有損害作用,LD50為1.24mg/kg。含毒素0.0078%的水溶物給白鼠飲用后即能引起肝、肺、膽囊的癌變。報告指出,食用前如煮沸10min可去掉99.5%的毒性。有關(guān)MMH的作用機理,認為是對γ-aminobutyricacid(GABA)的代謝阻礙所造成的。主要是MMH對合成GABA相關(guān)的GlutamicAcidDecarboxylase(GAD)和GABATransaminase(GABA-T)有抑制作用,從而制止GABA的產(chǎn)生。除了鹿花菌以外,馬鞍菌(Helvellaelastica),疣孢褐盤菌(Pezizabadia)中也含有相同的毒素。1.7日本法上的秋生鉻病毒屬別名焦腳菌、秋生鱗耳。為子實體較小的劇毒菌,形態(tài)上與蜜環(huán)菌(Armillariamellea)和光帽鱗傘(Pholiotanameko)的幼小子實體相近而易引起中毒。1957年至1974年間在日本有17例中毒病人,其中3人死亡。美國也有中毒報告,只是種類有所不同,是同屬的Galerinafasciculata或G.venenata引起的。目前已證明,它們中也含有鵝膏毒肽,盡管在量上有別,秋生盔孢菌含amanitin為1.5mg/g(干),邊緣盔孢菌(G.marginata)為1.45mg/g。由于該屬真菌含有與鵝膏屬相同的毒性成分,因此其毒性癥狀和機理也與鵝膏類相同。一般經(jīng)過14～20h的潛伏期后開始頭暈、頭痛、嘔吐、腹瀉、血壓下降、昏迷甚至死亡。2民間鑒別土辦法鑒定難關(guān)于毒蘑菇的鑒別從古至今有著各種各樣的探索,民間鑒別的土辦法就不少于幾十種。但是,真正依據(jù)所含的化學(xué)成分進行鑒定的卻寥寥無幾。現(xiàn)將文獻報道的少數(shù)毒蘑菇的化學(xué)鑒定法介紹如下。2.1亞側(cè)耳和生物測定月夜菌與亞側(cè)耳(Panellusserotinus)形態(tài)相似,但用BaSO4液(3mL純水加8mL濃硫酸,再加1gBa(OH)2溶解即可,10d內(nèi)有效)可容易鑒別,菌肉上滴1～2mL溶液后無顏色反應(yīng)者為毒菌月夜菌,而呈紅紫色的是美味食用菌亞側(cè)耳。有人利用月夜菌中所含的acidphosphatase(ACP)酶活性高,carboxyesterase(CE)酶活性低且能夠特異性地染色的原理,使用電泳法與含有同樣酶的、形態(tài)特征上容易混淆的香菇和側(cè)耳(Pleurotusostreatus)相區(qū)別。2.2薄層層析分離法毒性成分amanitins的鑒別曾使用Meixnertest法。此種方法比較簡便,將新鮮蘑菇的汁液或抽出液滴在新聞紙上,并使之吸收、干燥,然后再滴1滴濃鹽酸,據(jù)呈色反應(yīng)而決定。根據(jù)粕谷、山下等人對鵝膏屬和其它毒蘑菇的測定,結(jié)果不十分明顯,有中間類型和交叉現(xiàn)象。以濃縮的蘑菇汁液作材料,用氯仿ue5fe乙醚ue5fe醋酸ue5fe水為75ue5fe33ue5fe7.5ue5fe5作展開劑進行薄層層析,然后用1%的cinnamicaldehyde乙醚噴霧,在鹽酸蒸氣上顯色。在7種鵝膏與α-amanitin標(biāo)準(zhǔn)品進行薄層層析,只有白鵝膏和毒鵝膏的Rf值接近標(biāo)準(zhǔn)樣的0.19。總之,毒性成分的鑒別方法尚未成熟,還沒有一種簡便、通用的方法。目前毒蘑菇的鑒別主要是靠形態(tài)鑒別。應(yīng)該指出的是,有的蘑菇本身并沒有毒,但食用不適當(dāng)可引起不良反應(yīng)。如尖頂羊肚菌(Morchellaconica)、硫磺菌(Laetiporussulphureus)、黃汁乳菇(Lactariuschrysorheus)、黑菇(Russulanigricans)、蜜環(huán)菌、褐疣柄牛肝菌(Leccinumscabrum)等蘑菇生食容易中毒。而有的是因為食用量過多而引起中毒,如金黃枝瑚菌(Ramariaaurea)、毒蠅口蘑(Tricholomamuscarium)、毛釘菇(Gomphusfloccosus)等等。有人報道,香菇因超量食用引起腸梗阻。另外,有些蘑菇(如滑子蘑、香菇等)的孢粉對一些人有過敏現(xiàn)象。從嚴(yán)格意義上講,這些均不屬于毒蘑菇的范疇。3蘑菇及其毒性成分的開發(fā)3.1鹿花菌類物質(zhì)據(jù)文獻報道,有些毒菌在一定條件下是可食用的,如毒蠅鵝膏干燥半年以后加熱食用或用水、鹽水浸泡,剝掉蓋皮就可以安全食用;豹斑鵝膏干燥后也可以食用,而在古代西伯利亞地區(qū)曾經(jīng)做參戰(zhàn)士兵的興奮劑,或泡酒飲用,或用其蓋皮卷煙抽;鹿花菌的毒性成分MMH的沸點為83.5℃,因此,食用前煮沸片刻即可拔毒;膠鼓菌(Bulgariainquinans)的卟啉(pophyrins)類物質(zhì)經(jīng)草木灰或堿水浸泡后即可除掉。除了直接食用外,蘑菇體內(nèi)所含的一些可食用成分,如鵝膏菌含增味成分或香氣成分;毒蠅口蘑的增味成分的鮮度比味精(谷氨酸鈉)高20倍。3.2-amni有效治療小鼠細胞的增殖蘑菇毒素的藥用研究是目前一項熱門課題。如上所述,鵝膏屬的很多種類所產(chǎn)生的毒素amnitins對生活細胞具有強烈的破壞作用。由此人們就推想用它或用其衍生物去選擇性地殺死癌細胞,這是一種極具誘惑力的想象,實際上這項工作目前已有了一定的進展。Grna用α-amanitin醫(yī)治了氨基偶氮甲苯(aminoazotoluene)誘發(fā)的小鼠皮膚腫瘤,β-amanitin也有類似的應(yīng)用之例。然而,由于毒素成分的收率低,資源有限,又不能人工合成,所以此類產(chǎn)品在國際市場上價格十分昂貴(10萬美元/g)。amanitins也有抑制病毒復(fù)制的作用,粗提物也可做農(nóng)藥、殺蟲劑。光蓋菇屬菌所含的幻覺類物質(zhì)(gymnopilinA,B)對神經(jīng)病的