抗氧化功能評價方法

抗氧化功能評價方法------------------------------------------------------------------------------------------------抗氧化功能評價方法附件1:試驗項目、試驗原則及結果判定Items,PrinciplesandResultAssessment1試驗項目1.1動物實驗1.1.1體重1.1.2脂質氧化產物:丙二醛或血清8-表氫氧異前列腺素(8-Isoprostane)1.1.3蛋白質氧化產物:蛋白質羰基1.1.4抗氧化酶:超氧化物歧化酶或谷胱甘肽過氧化物酶1.1.5抗氧化物質:還原性谷胱甘肽1.2人體試食試驗1.2.1脂質氧化產物:丙二醛或血清8-表氫氧異前列腺素(8-Isoprostane)1.2.2超氧化物歧化酶1.2.3谷胱甘肽過氧化物酶2試驗原則2.1動物實驗和人體試食試驗所列的指標均為必測項目。2.2脂質氧化產物指標中丙二醛和血清8-表氫氧異前列腺素任選其一進行指標測定，動物實驗抗氧化酶指標中超氧化物歧化酶和谷——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------胱甘肽過氧化物酶任選其一進行指標測定。2.3氧化損傷模型動物和老齡動物任選其一進行生化指標測定。2.4在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。3結果判定3.1動物實驗:脂質氧化產物、蛋白質氧化產物、抗氧化酶、抗氧化物質四項指標中三項陽性，可判定該受試樣品抗氧化功能動物實驗結果陽性。3.2人體試食試驗:脂質氧化產物、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶三項指標中二項陽性，且對機體健康無影響，可判定該受試樣品具有抗氧化功能的作用。1抗氧化功能檢驗方法MethodfortheAssessmentofAntioxidativeFunction1動物實驗1.1實驗動物選用10月齡以上老齡大鼠或8月齡以上老齡小鼠，也可用氧化損傷模型鼠。單一性別，小鼠每組10,15只，大鼠8,12只。1.2劑量分組及受試樣品給予時間實驗設三個劑量組和一個溶劑對照組，以人體推薦量的10倍(小鼠)或5倍(大鼠)為其中的一個劑量組，另設兩個劑量組，高劑量一般不超過30倍，必要時設陽性對照組、空白對照組。受試樣品給予時間30天，必要時可延長至45天?！?-----------------------------------------------------------------------------------------------1.3實驗方法1.3.1老齡動物選用10月齡以上大鼠或8月齡以上小鼠，按血中MDA水平分組，隨機分為1個溶劑對照組和3個受試樣品劑量組。3個劑量組給予不同濃度受試樣品，對照組給予同體積溶劑，實驗結束時處死動物測脂質氧化產物含量、蛋白質羰基含量、還原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。1.3.2D,半乳糖氧化損傷模型1.3.2.1原理D-半乳糖供給過量，超常產生活性氧，打破了受控于遺傳模式的活性氧產生與消除的平衡狀態(tài)，引起過氧化效應。1.3.2.2造模方法選25-30g健康成年小鼠，除空白對照組外，其余動物用D-半乳糖40mg,1.2g/kgBW頸背部皮下注射或腹腔注射造模，注射量為0.1mL/10g，每日1次，連續(xù)造模6周，取血測MDA，按MDA水平分組。隨機分為1個模型對照組和3個受試樣品劑量組，3個劑量組經口給予不同濃度受試樣品，模型對照組給予同體積溶劑，在給受試樣品的同時，模型對照組和各劑量組繼續(xù)給予相同劑量D-半乳糖頸背部皮下或腹腔注射，實驗結束處死動物測脂質氧化產物含量、蛋白質羰基含量、還原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。1.3.3乙醇氧化損傷模型1.3.3.1原理——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------2乙醇大量攝入，激活氧分子產生自由基，導致組織細胞過氧化效應及體內還原性谷胱甘肽的耗竭。1.3.3.2造模方法選25,30g健康成年小鼠(180,220g大鼠)，隨機分為4個組，1個模型對照組和3個受試樣品劑量組，必要時可增設1個空白對照組。3個劑量組給予不同濃度受試樣品，模型對照組給予同體積溶劑，連續(xù)灌胃30天，末次灌胃后，模型組對照組和3個劑量組禁食16小時(過夜)，然后1次性灌胃給予50%乙醇12ml/kgBW，6小時后取材(空白對照組不作處理，不禁食取材)，測血清或肝組織脂質氧化產物含量、蛋白質羰基含量、還原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。1.3.4脂質氧化產物測定1.3.4.1血中過氧化脂質降解產物丙二醛(MDA)含量測定血中過氧化脂質降解產物丙二醛(MDA)含量可采用熒光法和比色法測定，方法任選其一。1.3.4.1.1熒光法1.3.4.1.1.1熒光法原理MDA(malondiadehycle)是細胞膜脂質過氧化的終產物之一，測其含量可間接估計脂質過氧化的程度。1個丙二醛(MDA)分子與2個硫代巴比妥酸(TBA)分子在酸性條件下共熱，形成粉紅色復合物。以波長536nm為激發(fā)光，在550nm有最強熒光強度。可用熒光法進行微量測定。——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------1.3.4.1.1.2儀器與試劑儀器:熒光分光光度計、微量加樣器、恒溫水浴鍋、普通離心機、混旋器、具塞離心管試劑:10mmol/L四乙氧基丙烷(貯備液，棕色瓶4?保存12個月)，臨用前用純水稀釋成1nmol/mL29mmol/L硫代巴比妥酸工作液硫代巴比妥酸EDTA.2H200.209g25mg1mg谷胱甘肽(還原型)酸水解液0.1mol/LH2SO40.1mol/LNa2SO4正丁醇用0.02mol/LNaOH50mL溶解(微溫助溶，棕色瓶4?保存2周)125mL125mL加水150mL用H2SO4調pH1.5，加水稀釋至500mL以上所用玻璃器皿均需經50,硝酸浸泡24h后，再經蒸餾水、雙蒸水淋洗干燥，試劑3(選AR級)最好用雙蒸水配制。1.3.4.1.1.3實驗步驟1.3.4.1.1.3.1樣品制備——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------全血上清液:取血50μl加入0.5mL生理鹽水，2000r/min離心10min，取上清液待測。血清樣品:取血0.5mL室溫靜置10min，2000r/min離心10min，取上清液待測。1.3.4.1.1.3.2標準曲線制作將10nmol/mL四乙氧基丙烷，用雙蒸水稀釋成0.0、0.25、0.5、1.0、1.5、2、3、5、10nmol/mL分別取0.1mL加入酸水解液2mL、TBA工作液0.5mL?混勻，避光、沸水浴60min?流水冷卻至室溫?3mL正丁醇振蕩抽提1min?3000r/min離心5min?取上清液(正丁醇層)測熒光強度(入射狹縫1.5nm，出射狹縫5nm，激發(fā)波長536nm，發(fā)射波長550nm)以四乙氧基丙烷濃度為橫坐標，熒光強度為縱坐標作圖。1.3.4.1.1.3.3樣品測定試劑10mL具塞離心管酸水解液TBA工作液正丁醇空白管0.1mL蒸餾水2mL0.5mL3mL樣本管0.1mL血清*2mL0.5mL3mL標準管0.1mL標準,2mL0.5mL3mL混勻，避光沸水浴60min，流水冷卻振蕩抽提1min，3000r/min離心5min*全血上清液0.5mL(空白管加蒸餾水0.5mL，標準管加標準0.1mL、蒸餾水0.4mL),1nmol/mL四乙氧基丙烷(標準)——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------血清0.1mL(或全血上清液0.5mL)?加入酸水解液2mL、TBA工作液0.5mL?混勻，避光、沸水浴60min?流水冷卻至室溫?3mL正丁醇振蕩抽提1min?3000r/min離心5min?取上清液(正丁醇層)測熒光強度(入射狹縫1.5nm，出射狹縫5nm，激發(fā)波長536nm，發(fā)射波長550nm)1.3.4.1.1.3.4計算公式:B-AB-A過氧化脂質含量(nmol/mL血清),———×C×K=————×1×1F-AF-AB-AB-A1過氧化脂質含量(nmol/mL血液),———×C×K=———×1×————F-AF-A0.05A:空白管熒光度B:樣品熒光度F:四乙氧基丙烷熒光度C:四乙氧基丙烷濃度(1nmol/mL)K:稀釋倍數(shù)41.3.4.1.2比色法1.3.4.1.2.1比色法原理MDA(malondiadehycle)是細胞膜脂質過氧化的終產物之一，測——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------其含量可間接估計脂質過氧化的程度。1個丙二醛(MDA)分子與2個硫代巴比妥酸(TBA)分子在酸性條件下共熱，形成粉紅色復合物。該物質在波長532nm有極大吸收峰?？捎梅止夤夥ㄟM行測定。1.3.4.1.2.2儀器與試劑儀器:可見光分光光度計、酶標儀、微量加樣器、恒溫水浴鍋、普通離心機、混旋器、具塞離心管。試劑:0.2M乙酸鹽緩沖液pH3.50.2M乙酸溶液185mL0.2M乙酸鈉溶液15mL1mmol/L四乙氧基丙烷(貯備液，4?保存3個月)，臨用前用水稀釋成40nmol/mL8.1%十二烷基硫酸鈉SDS0.8%硫代巴比妥酸TBA0.2M磷酸鹽緩沖液pH7.40.2M磷酸氫二鈉1920mL0.2M磷酸二氫鉀480mL1.3.4.1.2.3實驗步驟1.3.4.1.2.3.1樣品制備溶血液樣品:取血20μL加入0.98mL蒸餾水制成2,溶血液。1.3.4.1.2.3.2樣品測定試劑2,溶血液*40nmol/mL四乙氧基丙烷8.1%SDS0.2M乙酸鹽緩沖液0.8%TBAH2O空白管0.2mL1.5mL1.5mL0.8mL樣品管0.2mL0.2mL1.5mL1.5mL0.6mL標準管——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------0.2mL0.2mL1.5mL1.5mL0.6mL混勻，避光沸水浴60min，流水冷卻，于532nm比色注:如用試劑盒，可按試劑盒的操作要求進行。*若用血清，樣品管0.15mL，標準管0.15mL。1.3.4.1.2.3.3計算B–AB–A過氧化脂質含量(nmol/mL2%溶血液),————×C×K=—————×40×1F–AF–AB–AB–A過氧化脂質含量(nmol/mL血清),————×C×K=—————×40×1F–AF–A5A:空白管吸光度B:樣品吸光度F:四乙氧基丙烷吸光度C:四乙氧基丙烷濃度(40nmol/mL)K:稀釋倍數(shù)1.3.4.2組織中過氧化脂質降解產物丙二醛(MDA)含量測定1.3.4.2.1原理見1.3.4.1.2.11.3.4.2.2儀器與試劑儀器:可見光分光光度計、酶標儀、微量加樣器、恒溫水浴鍋、普通離心機、混旋器、具塞離心管、組織勻漿器試劑:見1.3.4.1.2.21.3.4.2.3實驗步驟1.3.4.2.3.1樣品制備——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------組織勻漿樣品:取一定量的所需臟器，生理鹽水沖洗、拭干、稱重、剪碎，置勻漿器中，加入0.2M磷酸鹽緩沖液，以20000r/min勻漿10s，間歇30s，反復進行3次，制成10,組織勻漿(W/V)，3000r/min離心5,10min，取上清液待測。1.3.4.2.3.2樣品測定試劑10,組織勻漿40nmol/mL四乙氧基丙烷8.1%SDS0.2M乙酸鹽緩沖液0.8%TBAH2O空白管0.2mL1.5mL1.5mL0.8mL樣品管0.2mL0.2mL1.5mL1.5mL0.7mL標準管0.2mL0.2mL1.5mL1.5mL0.7mL混勻，避光沸水浴60min，流水冷卻，于532nm比色注:如用試劑盒，可按試劑盒的操作要求進行1.3.4.2.3.3計算B-AB-A1過氧化脂質含量,————×C×K=———×40×————————(nmol/mg組織)F-AF-A0.2×10%×1000A:空白管吸光度B:樣品管吸光度F:四乙氧基丙烷吸光度C:四乙氧基丙烷濃度(40nmol/mL)K:稀釋倍數(shù)1.3.4.3血清中8-表氫氧-異前列腺素(8-Isoprostane)測定——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------1.3.4.3.1原理68-表氫氧-異前列腺素(8-Isoprostane)是體內脂質氧化應激反應穩(wěn)定而具有特異性的標志物，其含量能間接反應因機體內自由基的產生而導致組織細胞的脂質過氧化程度。1.3.4.3.2儀器與試劑儀器:酶標儀、生化培養(yǎng)箱、微量振蕩器、微量加樣器、洗板機試劑:8-IsoprostaneKIAKit(酶聯(lián)免疫試劑盒)8-IsoprostaneEIA抗體血清、8-IsoprostaneAChE示蹤物、8-IsoprostaneEIA標準品、EIA緩沖液、洗滌緩沖液、吐溫20、鼠抗-兔IgG抗體、EIA示蹤染色劑、EIA抗體血清染色劑、Ellman’s試劑1.3.4.3.3實驗步驟1.3.4.3.3.1樣品制備小鼠眼內眥靜脈叢取血，3000r/min離心10min。取上清液，用EIA緩沖液稀釋15倍備用。1.3.4.3.3.2樣品測定按試劑盒說明操作。8-表氫氧異前列腺素標準孔濃度分別為:500pg/mL、200pg/mL、80pg/mL、32pg/mL、12.8pg/mL、5.1pg/mL、2.0pg/mL、0.8pg/mL標準或樣品孔吸光度—NSB孔吸光度%B/B0=——————————————————×100B0孔吸光度—NSB孔吸光度以標準物的濃度的對數(shù)(log)為橫坐標，%B/B0為縱坐標繪制標準曲線，亦可將數(shù)據(jù)轉換成logit(B/B0)或ln[B/B0/(1-B/B0)]做為縱坐——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------標繪制標準曲線，計算回歸方程。將樣品的%B/B0值，代入方程式，計算出樣品的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品中的8-表氫氧異前列腺素濃度。1.3.5蛋白質氧化產物測定H2O2或O2?ˉ自由基對蛋白質氨基酸側鏈的氧化可導致羰基產物的積累。羥自由基也可直接作用于肽鏈，使肽鏈斷裂，引起蛋白質一級結構的破壞，在斷裂處產生羰基。羰基化蛋7白極易相互交聯(lián)、聚集為大分子從而降低或失去原有蛋白質的功能，蛋白質羰基含量可直接反映蛋白質損傷的程度。蛋白質羰基形成是多種氨基酸在蛋白質的氧化修飾過程中的早期標志，它隨著年齡的增長而增加。1.3.5.1血清中蛋白質羰基測定1.3.5.1.1原理被氧化后的蛋白質羰基含量增多，羰基可與2，4-二硝基苯肼反應生成2，4-二硝基苯腙，2，4(二硝基苯腙為紅棕色的沉淀，將沉淀用鹽酸胍溶解后即可在分光光度計上讀取370nm下的吸光度值，從而測定蛋白質的羰基含量。1.3.5.1.2儀器與試劑儀器:紫外分光光度計、酶標儀、微量加樣器、生化培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、低溫高速離心機、混旋器、2ml離心管。試劑:10mmol/L2，4-二硝基苯肼(DNPH)99毫克2，4-二硝基苯肼用50ml2mol/LHCL溶解，4?避光保存。2mol/LHCL200g/L三氯乙酸(TCA)6mol/L鹽酸胍——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------無水乙醇乙酸乙酯混合應用液將無水乙醇和乙酸乙酯按照體積比1:1的比例配置成混合溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。1.3.5.1.3操作步驟渦旋混勻，將全部沉淀溶解，以12000r/min離心15min，取上清液在370nm處比色，6mol/L鹽酸胍試劑調零，測定OD值。用雙縮脲法測定血清(或血漿)蛋白質含量。注:如用試劑盒，可按試劑盒的操作要求進行。81.3.5.1.4計算公式測定管OD-對照管OD蛋白質羰基含量=——————————————————————×125×105(nmol/mgprot)22×比色光徑(cm)×樣本蛋白濃度(mg/L)1.3.5.2組織中蛋白質羰基測定1.3.5.2.1原理見1.3.5.1.11.3.5.2.2儀器與試劑儀器:紫外分光光度計、酶標儀、微量加樣器、生化培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、天平、勻漿器、低溫高速離心機、混旋器、2ml離心管。試劑:10mmol/LHEPES緩沖液pH7.42.38克N-2-羥乙基哌嗪-2’-乙磺酸(HEPES)溶入1000ml雙蒸——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------餾水，用lNNaOH調pH至7.4，4?保存。100g/L硫酸鏈霉素1g硫酸鏈霉素，溶入10ml雙蒸餾水，4?避光保存。10mmol/L2，4-二硝基苯肼(DNPH)99毫克2，4-二硝基苯肼用50ml2mol/LHCL溶解，4?避光保存。2mol/LHCL200g/L三氯乙酸(TCA)6mol/L鹽酸胍無水乙醇乙酸乙酯混合應用液將無水乙醇和乙酸乙酯按照體積比1:1的比例配置成混合溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。1.3.5.2.3實驗步驟1.3.5.2.3.1樣品處理取0.1g組織，在冰的生理鹽水中漂洗，以去掉表面的血跡。加人0.9ml的冰的10mmol/LHEPES緩沖液(pH7.4)，制成10,的勻漿。將勻漿液以3000r/min的轉速，離心10min，保留上清。取100g,L的硫酸鏈霉素溶液50μl，加入上清液450μl(v/v,1:9)，室溫放置10min后，以11000r/min的轉速，離心10min，取上清液待測。9渦旋混勻，將全部沉淀溶解，以12000r/min離心15min，取上清液在370nm處比色，6mol/L鹽酸胍試劑調零，測定OD值。用雙縮——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------脲法測定勻漿上清液蛋白質含量。注:如用試劑盒，可按試劑盒的操作要求進行。1.3.5.2.3.3計算公式測定管OD-對照管OD蛋白質羰基含量=——————————————————————×125×105(nmol/mgprot)22×比色光徑(cm)×樣本蛋白濃度(mg/L)1.3.5.3注意事項1.3.5.3.1加入硫酸鏈霉素:在勻漿上清液中加人硫酸鏈霉素溶液的作用是沉淀核酸。核酸中的一些堿基如鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶等也含有羰基，如不去除核酸，這些堿基就會與DNPH結合，并反應生成有色物質，這些物質會增加最后溶液的吸光度，使結果偏大。1.3.5.3.2DHPH的溶解:DNPH不溶于水，只能溶于稀酸和稀堿等溶液，因此，用2mol,LHC1來溶解DNPH。設對照管是為了避免HC1與反應液中一些物質反應生成對比色有影響的物質。1.3.5.3.3反應體系應避光:當?shù)鞍踪|溶液中加人DNPH進行反應時，反應體系需置于黑暗中，因為DNPH不穩(wěn)定，見光會分解。如果反應體系遇到光，DNPH分解，體系中會有剩余的沒有變成蛋白質腙衍生物，對反應比色有影響。1.3.5.3.4去除未與蛋白質結合的DNPH:由于DNPH在370nm左右有強烈的光吸收，因而用乙醇和乙酸乙脂混合物反復洗滌沉淀，去——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------掉未與蛋白質結合的DNPH，否則，會增加吸光值。1.3.6抗氧化酶活力測定SOD催化超氧陰離子自由基(O2?ˉ)生成H2O2，再由其它抗氧化酶如谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和過氧化氫酶作用生成水，這樣可以清除O2?ˉ對細胞的毒害作用。SOD、GSH-Px在動物某些器官和人體血紅細胞中的含量均有明顯的增齡變化，酶活性與生物年齡的增長成反比。消除自由基的能力與酶活性成正比。1.3.6.1血或組織中超氧化物歧化酶(SOD)活力測定1.3.6.1.1原理O2?ˉ氧化羥胺的最終產物為亞硝酸鹽，后者在對氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈現(xiàn)紫紅色，在波長530nm處有極大吸收峰，可用分光光度法進行測定，當SOD消除O2?ˉ后形成的亞硝酸鹽減少。1.3.6.1.2儀器與試劑儀器可見光分光光度計、酶標儀、離心機、恒溫水浴、勻漿器試劑65mM磷酸鹽緩沖液(PBS)pH7.81010mmol/L鹽酸羥胺鹽酸羥胺6.95mg，加PBS至10mL7.5mmol/L黃嘌呤黃嘌呤11.41mg，加0.1MNaOH2.5mL溶解，加PBS至10mL0.2g/L黃嘌呤氧化酶取10g/L黃嘌呤氧化酶0.2mL加冰冷PBS9.8mL至10mL——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------0.1%甲萘胺取0.2gα-甲萘胺溶于40mL沸蒸餾水，涼至室溫加50mL冰醋酸，再加110mL涼蒸餾水至200mL0.33%對氨基苯磺酸取0.66g對氨基苯磺酸溶于150mL溫蒸餾水，加50mL冰醋酸至200mLSOD標準品三氯甲烷95,乙醇(v/v)0.9%生理鹽水1.3.6.1.3實驗步驟紅細胞抽提液制備:10μl全血沖入0.5mL生理鹽水，2000r/min離心3min，棄上清，加冰冷的雙蒸水0.2mL混勻，加入95,乙醇0.1mL，振蕩30s，加入三氯甲烷0.1mL，置快速混合器抽提1min，4000r/min離心3min，分層，上層為SOD抽提液，中層為血紅蛋白沉淀物，下層為三氯甲烷，記錄上清液體積待測。組織勻漿的制備:剪取一定量的所需臟器，生理鹽水沖洗、拭干、稱重、剪碎，至玻璃勻漿器中加入冷生理鹽水20000r/min勻漿10s，間歇30s，反復進行三次，制成1,組織勻漿，(最好用超聲波發(fā)生器處理30s)，使線粒體振破，以中性紅,詹鈉氏綠B染色證明線粒體已振碎。以4000r/min離心5min，取上清液20μl待測。SOD標準抑制曲線將SOD標準品用磷酸鹽緩沖液配制成——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------750U/mL的溶液，再稀釋到50倍，即SOD量為15U/mL(1.5μg/mL)，用本法測定不同量的SOD標準液的百分抑制率，以百分抑制率為縱坐標，以SOD活力單位U/mL為橫坐標繪制標準曲線。對照管OD,測定管ODSOD百分抑制率,??????????????×100,對照管OD計算每mL反應液中SOD抑制率達50,時所對應的SOD量為一個單位。100,對照管OD反應液總量(6mL)SOD活力(U/mL),?????????×??????????×樣品稀釋倍數(shù)50,取液量也可用酶比活法即以每管樣品的百分抑制率從SOD標準曲線查出相應的SODU/mL，乘以稀釋倍數(shù)(1mL/取樣量)。若樣品為組織勻漿液，根據(jù)勻漿濃度或組織蛋白質含量，將單位換算為U/g組織或U/mg蛋白。若樣品為紅細胞抽提液，根據(jù)血紅蛋白含量，可換算為U/gHb。11樣品測定步驟:試劑1/15mol/L磷酸鹽緩沖液pH7.8(mL)樣品——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------10mmol/L鹽酸羥胺(mL)7.5mmol/L黃嘌呤(mL)0.2mg/mL黃嘌呤氧化酶(mL)雙蒸水(mL)測定管1.0A*0.10.20.20.49混勻，37?恒溫水浴30min0.33%對氨基苯磺酸(mL)0.1%甲萘胺(mL)*A所用樣品的量紅細胞抽提液血清(或血漿)1%組織勻漿10μl20,30μl(溶血樣品剔除)10,40μl對照管1.00.10.20.20.492.02.02.02.0混勻15min后，倒入1cm光徑比色杯，以蒸餾水調零，530nm處比色測定OD值。注:如用試劑盒，可按試劑盒的操作要求進行。1.3.6.2血或組織中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH,Px)活力測定1.3.6.2.1原理谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)是體內存在的一種含硒清除自由基和抑制自由基反應的系統(tǒng)。對防止體內自由基引起膜脂質過氧化特別重要，其活力以催化GSH氧化的反應速度，及單位時間內GSH減少的量來表示，GSH和5,5’-二硫對硝基苯甲酸(DTNB)反應在GSH-Px催化下可生成黃色的5-硫代2-硝基苯甲酸陰離子，于423nm波長有——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------最大吸收峰，測定該離子濃度，即可計算出GSH減少的量，由于GSH能進行非酶反應氧化，所以最后計算酶活力時，必須扣除非酶反應所引起的GSH減少。1.3.6.2.2試劑和儀器儀器:可見光分光光度計、酶標儀、低溫高速離心機、勻漿器、恒溫水浴鍋、微量加樣器試劑:疊氮鈉磷酸緩沖液pH7.0NaN3EDTA-Na2Na2HPO4NaH2PO416.25mg7.44mg1.732g1.076g終濃度2.5mmol/L終濃度0.2mmol/L終濃度0.2mol/L終濃度0.2mol/L加蒸餾水至100mL，用少量HCL、NaOH調pH7.0，4?保存。1mmol/L谷胱甘肽(還原型GSH)溶液GSH30.7mg加疊氮鈉磷酸緩沖液至100mL，臨用前配制，冰凍保存1,2日。1.25,1.5mmol/LH2O2溶液取30,H2O20.15,0.17mL，用雙蒸水稀釋至100mL，作為貯備液，4?避光保存，臨12用前將貯備液用雙蒸水稀釋10倍即可。偏磷酸沉淀液HPO3EDTANaCl——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------0.32mol/LNa2HPO4溶液:Na2HPO422.7g加蒸餾水至500mL，室溫保存。DTNB顯色液DTNB檸檬酸三鈉0.2M磷酸緩沖液pH7.40.9%生理鹽水1.3.6.2.3實驗步驟1.3.6.2.3.1樣品制備溶血液:取鼠血10μl加入到1mL雙蒸水中，充分振搖，使之全部溶血1:100待測，4h內測定酶活力。若當天來不及測定，將肝素抗凝全血置-20?凍存，3d內測定，若4?存放，28h內必須測完。測前取出樣品室溫自然解凍。組織上清液:動物禁食過夜，處死后，立即取出所需臟器，放入冷生理鹽水中洗去浮血，剔除脂肪及結締組織，濾紙吸干后，在冰浴上剪成碎塊，稱取適量組織，加冷0.2M磷酸緩沖液，以20000r/min勻漿10s，間歇30s，反復3次制成5%組織勻漿，操作在冰浴中進行，勻漿以12500×g離心10min(低溫高速離心機)，以沉淀為破碎的細胞、細胞碎片、核及線粒體，上清液用以測胞液中的酶活力，最好當天測，否則加20,(v/v)甘油分裝于塑料管，放置-20,-80?，可保存數(shù)周，而酶活力不減。1.3.6.2.3.2GSH標準曲線的制作:——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------取1.0mmol/LGSH溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分別置于10mL小容器瓶中，各加入偏磷酸沉淀劑8mL，用雙蒸水稀釋至10mL刻度，即得到濃度為0、20、40、60、80、100μmol/L的GSH標準液。取上述不同濃度標準液各2mL，放入試管中，加入0.32mol/LNa2HPO42.5mL，比色前加入DTNB顯色液0.5mL用光徑1cm杯，5min內在可見光423nm波長測OD值，以雙蒸水調零點。以GSH含量(μmol/L)為橫坐標，OD423值為縱坐標，繪制標準曲線。1.3.6.2.3.3測定步驟:試劑1.0mmol/LGSH樣品**雙蒸水*樣品管(mL)0.40.4非酶管(mL)0.40.4空白管(mL)40mg1.0g16.7g(先用蒸餾水溶解)0.5g280g加蒸餾水至1000mL，用普通濾紙過濾，室溫保存。加蒸餾水至100mL，4?避光保存1個月。1337?水浴預溫5minH2O2(37?預熱)偏磷酸沉淀液0.20.2——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------37?水浴準確反應3min(嚴格控制時間)43000r/min離心10min離心上清液雙蒸水偏磷酸沉淀液0.32mol/LNa2HPO4DTNB顯色液22.50.522.50.50.41.62.50.54顯色反應1min后于423nm波長(1cm光徑)，讀OD值，5min之內讀數(shù)準確。*樣品為組織上清液時，非酶管改為加熱使酶失活的組織上清液。**溶血液0.1,0.4mL組織上清液1:20稀釋，取稀釋液0.4mL注:如用試劑盒，可按試劑盒的操作要求進行。1.3.6.2.3.4計算鼠全血GSH-Px活力單位規(guī)定每1mL全血，每分鐘，扣除非酶反應的log[GSH]降低后，使log[GSH]降低1為一個酶活力單位。非酶管log[GSH]-樣品管log[GSH]鼠全血GSH-Px活力單位(U/mL全血)=????????????????3min×0.004mL——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------log[非酶管OD,空白管OD]-log[樣品管OD-空白管OD]=????????????????????????3min×0.004mL組織GSH-Px比活力單位規(guī)定每毫克蛋白質，每分鐘，扣除非酶反應，使GSH濃度降低1μmol/L為一個酶活力單位。(非酶管OD,樣品管OD)×A**×5組織GSH-Px比活力單位(U/mg蛋白)=???????????????????3min×樣品蛋白質的mg數(shù)**Folin法或雙縮脲法測樣品蛋白質含量標準GSH濃度(μmol/L)**A=???????????即標準曲線斜率。標準GSH光密度(OD)1.3.6.2.4注意事項1.3.6.2.4.1由于H2O2易分解導致濃度改變，臨用時取貯備液用分光光度計測其濃度，取貯備液3mL，測定1cm光徑的240nm處OD值。OD濃度(mmol/L),————————0.036(消光系數(shù))若OD值為0.45，則表明H2O2濃度為12.5mmol/L。1.3.6.2.4.25-硫代2-硝基苯甲酸陰離子的顯色不僅與整個反應體系中氫離子濃度有關，還——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------14受反應時間限制。加入顯色劑后，反應體系pH為6.5時，11min開始顯色，此時比色5min內讀數(shù)準確。1.3.7抗氧化物質還原型谷胱甘肽(GSH)測定谷胱甘肽是一種低分子清除劑，它可清除O2-、H2O2、LOOH。谷胱甘肽是谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸組成的一種三肽，是組織中主要的非蛋白質的巰基化合物，是GSH-PX和GST兩種酶類的底物，為這兩種酶分解氫過氧化物所必需，它能穩(wěn)定含巰基的酶，和防止血紅蛋白及其它輔助因子受氧化損傷，缺乏或耗竭GSH會促使許多化學物質或環(huán)境因素產生中毒作用，GSH量的多少是衡量機體抗氧化能力大小的重要因素。1.3.7.1血或組織中還原型谷胱甘肽(GSH)測定方法1.3.7.1.1原理GSH-和5，5'-二硫對硝基甲酸(DTNB)反應在GSH-Px催化下可生成黃色的5-硫代2-硝基甲酸陰離子，于420nm波長有最吸收峰，測定該離子濃度，即可計算GSH的含量。1.3.7.1.2儀器和試劑儀器:可見光分光光度計、酶標儀、低溫高速離心機、勻漿器、恒溫水浴鍋、微量加樣器試劑:0.9,生理鹽水4,磺基水楊酸溶液0.1mol/LPBS溶液(pH=8.0):——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------稱取Na2HPO413.452g，KH2PO40.722g，加蒸餾水至1000mL。0.004,DTNB溶液:稱取DTNB40mg溶于1000mL的0.1mol/LPBS溶液(pH=8.0)中。疊氮納緩沖液:NaN3EDTA-Na2Na2HPO4NaH2PO416.25mg7.44mg1.732g1.076g加蒸餾水至1000mL，用少量HCl、NaOH調pH7.0，4?保存。標準溶液:稱取還原型GSH15.4mg，加疊氮納緩沖液至50mL，終濃度為1mmol/L，臨用前配制。1.3.7.1.3實驗步驟1.3.7.1.3.1樣品制備:溶血液上清液:取0.1mL抗凝全血加雙蒸水0.9mL(1:9溶血液)，充分混勻，直至透亮為止。取溶血液0.5mL加4%磺基水楊酸0.5mL混勻，室溫下3500rpm離心10分鐘，取上清液備用。血清上清液:取0.1mL血清加4%磺基水楊酸0.1mL混勻，室溫下3500rpm離心10分鐘，取上清液備用。組織上清液:取組織0.5g加生理鹽水4.5mL充分研磨成細漿(10%肝勻漿)，混勻后取15——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------漿液0.5mL加4%磺基水楊酸0.5mL混勻，室溫下3500rpm離心10分鐘，取上清液備用。1.3.7.1.3.2樣品測定:溶血液或組織樣品測定:上清液4%磺基水楊酸DTNB血清樣品測定:上清液4%磺基水楊酸DTNB測定管0.1mL,0.9mL空白管,0.1mL0.9mL測定管0.5mL,4.5mL空白管,0.5mL4.5mL混勻，室溫放置10分鐘后，420nm處測定吸光度?；靹?，室溫放置10分鐘后，420nm處測定吸光度。注:該指標檢測，需新鮮樣品取材后當天完成。用雙縮脲法測定血清(或溶血液)、組織勻漿蛋白質含量。如用試劑盒，可按試劑盒的操作要求進行。1.3.7.1.3.3標準曲線取1mmol/LGSH標準溶液0、10、20、50、100、150、200μL,分別加入生理鹽水至0.5mL，即得到0、20、40、100、200、300、400μmol/L的GSH標準液系列，各管加入DTNB4.5mL，混勻，室溫放置10分鐘后，空白管調零，420nm處測定吸光度。以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，做標準曲線?！?-----------------------------------------------------------------------------------------------1mmol/LGSH(mL)生理鹽水(mL)DTNB(mL)GSH量(?mol/L)1.3.7.1.3.4計算樣品GSH含量=對應曲線濃度值(?mol/L)×溶血液稀釋倍數(shù)×上清液稀釋倍數(shù)(?mol/L全血)=對應曲線濃度值(?mol/L)×10×2樣品GSH含量=對應曲線濃度值(?mol/L)×上清液稀釋倍數(shù)(?mol/L血清)=對應曲線濃度值(?mol/L)×2樣品GSH含量=對應曲線濃度值(?mol/L)×上清液稀釋倍數(shù)?上清液組織含量(?mol/g組織)=對應曲線濃度值(?mol/L)×2?100g組織/L樣品GSH含量=對應曲線濃度值(?mol/L)×上清液稀釋倍數(shù)?上清液蛋白含量(?mol/gprot)=對應曲線濃度值(?mol/L)×2?勻漿gprot/L16100.504.50020.010.494.502030.020.484.504040.050.454.5010050.100.404.5020060.150.354.5030070.200.304.504001.4數(shù)據(jù)處理與結果判定——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------1.4.1數(shù)據(jù)處理一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F(xiàn)值<F0.05，結論:各組均數(shù)間差異無顯著性;F值?F0.05，P?0.05，用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計;對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計;若變量轉換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。1.4.2指標判定1.4.2.1脂質氧化產物受試樣品組與模型(或老齡)對照組比較，過氧化脂質(丙二醛或8-表氫氧異前列腺素)含量降低有統(tǒng)計學意義，判定該受試樣品有降低脂質過氧化作用，該項指標結果陽性。1.4.2.2蛋白質氧化產物受試樣品組與模型(或老齡)對照組比較，蛋白質羰基含量降低有統(tǒng)計學意義，判定該受試樣品有降低蛋白質過氧化作用，該項指標結果陽性。1.4.2.3抗氧化酶活力受試樣品組與模型(或老齡)對照組比較，抗氧化酶(SOD或GSH-PX)活力升高有統(tǒng)計學意義，判定該受試樣品有升高抗氧化酶活力作用，該項指標結果陽性。1.4.2.4抗氧化物質GSH受試樣品組與模型(或老齡)對照組比較，GSH含量升高有統(tǒng)計——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------學意義，判定該受試樣品有升高抗氧化物質GSH作用，該項指標結果陽性。1.4.3結果判定過氧化脂質含量、蛋白質羰基、抗氧化酶活性、還原性谷胱甘肽四項指標中三項指標陽性，可判定該受試樣品抗氧化動物實驗結果陽性。2人體試食試驗2.1受試者納入標準選年齡在18,65歲，身體健康狀況良好，無明顯腦、心、肝、肺、腎、血液疾患，無長期服藥史，志愿受試保證配合的人群。2.2排除受試者標準2.2.1妊娠或哺乳期婦女，對保健食品過敏者。2.2.2合并有心、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴重疾病患者。2.2.3短期內服用與受試功能有關的物品，影響到對結果的判斷者。2.2.4不符合納入標準，未按規(guī)定食用受試樣品，無法判定功效或資料不全影響功效或安全17性判斷者。2.3受試者分組對受試者按MDA、SOD、GSH-Px水平隨機分為試食組和對照組，盡可能考慮影響結果的主要因素如年齡、性別、生活飲食習慣等，進——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------行均衡性檢驗，以保證組間的可比性。每組受試者不少于50例。2.4試驗方法采用自身和組間兩種對照設計。試驗組按推薦服用方法、服用量每日服用受試產品，對照組可服用安慰劑或采用陰性對照。受試樣品給予時間3個月，必要時可延長至6個月。試驗期間對照組和試食組原生活、飲食不變。2.5觀察指標各項指標在試驗開始及結束時各檢測1次。2.5.1安全性指標2.5.1.1一般狀況包括精神、睡眠、飲食、大小便、血壓等2.5.1.2血、尿、便常規(guī)檢查2.5.1.3肝、腎功能檢查2.5.1.4胸透、心電圖、腹部B超檢查2.5.2功效指標2.5.2.1過氧化脂質含量觀察試驗前后MDA的變化及MDA下降百分率。(測定方法見1.3.3.1)試驗前MDA—試驗后MDAMDA下降百分率=?100%試驗前MDA觀察試驗前后8-Isoprostane的變化及8-Isoprostane下降百分率。(測定方法見2.8)——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------試驗前8-Isoprostane—試驗后8-Isoprostane8-Isoprostane下降百分率=?100%試驗前8-Isoprostane2.5.2.2超氧化物歧化酶觀察試驗前后SOD的變化及SOD升高百分率。(測定方法見1.3.4.1)試驗前SOD—試驗后SODSOD升高百分率=?100%試驗前SOD2.5.2.3谷胱甘肽過氧化物酶觀察試驗前后GSH,PX的變化及GSH,PX升高百分率。(測定方法見2.7)18試驗前GSH,PX—試驗后GSH,PXGSH,PX升高百分率=×100%試驗前GSH,PX2.6數(shù)據(jù)處理和結果判定凡自身對照資料可以采用配對t檢驗，兩組均數(shù)比較采用成組t檢驗，后者需進行方差齊性檢驗，對非正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D換，待滿足正態(tài)方差齊后，用轉換的數(shù)據(jù)進行t檢驗;若轉換數(shù)據(jù)仍不能滿足正態(tài)方差齊要求，改用t’檢驗或秩和檢驗;但變異系數(shù)太大(如CV>50,)的資料應用秩和檢驗。在試驗前組間比較差異無顯著性的前提下，可進行試驗后組間比較?！?-----------------------------------------------------------------------------------------------各功效觀察指標試驗前后自身比較和試食后組間比較均有統(tǒng)計學意義，方可判定該指標陽性。過氧化脂質含量、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶三項實驗中任二項實驗結果陽性，可判定該受試樣品具有抗氧化功能作用。2.7血中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH,Px)活力測定2.7.1原理谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)是體內存在的一種含硒清除自由基和抑制自由基反應的系統(tǒng)。對防止體內自由基引起膜脂質過氧化特別重要，其活力以催化GSH氧化的反應速度，及單位時間內GSH減少的量來表示，GSH和5，5’-二硫對硝基苯甲酸(DTNB)反應在GSH-Px催化下可生成黃色的5-硫代2-硝基苯甲酸陰離子，于423nm波長有最大吸收峰，測定該離子濃度，即可計算出GSH減少的量，由于GSH能進行非酶反應氧化，所以最后計算酶活力時，必須扣除非酶反應所引起的GSH減少。2.7.2試劑和儀器儀器:可見光分光光度計、酶標儀、恒溫水浴鍋、微量加樣器、離心機試劑:疊氮鈉磷酸緩沖液pH7.0NaN3EDTA-Na2Na2HPO4NaH2PO416.25mg7.44mg1.732g1.076g終濃度2.5mmol/L終濃——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------度0.2mmol/L終濃度0.2mol/L終濃度0.2mol/L加蒸餾水至100mL，用少量HCL、NaOH調pH7.0，4?保存。1mmol/L谷胱甘肽(還原型GSH)溶液GSH30.7mg加疊氮鈉磷酸緩沖液至100mL，臨用前配制，冰凍保存1,2日。1.25,1.5mmol/LH2O2溶液取30,H2O20.15,0.17mL，用雙蒸水稀釋至100mL，作為貯備液，4?避光保存，臨用前將貯備液用雙蒸水稀釋10倍即可。偏磷酸沉淀液19HPO3EDTANaCl0.32mol/LNa2HPO4溶液:16.7g(先用蒸餾水溶解)0.5g280g加蒸餾水至1000mL，用普通濾紙過濾，室溫保存。Na2HPO422.7g加蒸餾水至500mL，室溫保存。DTNB顯色液DTNB檸檬酸三鈉40mg1.0g加蒸餾水至100mL，4?避光保存1個月。2.7.3實驗步驟2.7.3.1樣品制備溶血液:取血20μ