補腎健脾方對脾腎兩虛型大鼠骨質(zhì)疏松癥的治療作用

補腎健脾方對脾腎兩虛型大鼠骨質(zhì)疏松癥的治療作用

中醫(yī)認為，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生與脾虛是其根本原因。脾虛是主要原因之一。脾虛與腎虛有關(guān)。因此,補腎法、健脾法及補腎健脾法均是骨質(zhì)疏松癥治療的重要法則。本研究在此理論基礎(chǔ)上,深入探討補腎健脾方對脾腎兩虛型大鼠骨質(zhì)疏松癥的治療作用,對補腎法、健脾法以及補腎健脾法對其的治療作用進行對比分析,以期為骨質(zhì)疏松發(fā)生過程中脾腎相關(guān)性研究提供實驗依據(jù)。材料表面1.強、弱、小分子的風(fēng)險選用健康雌性SPF級Wistar大鼠86只,體質(zhì)量200-220g,由中國藥品生物制品檢定所提供,許可證編號:SCXK(京)2009-0017,在中日友好醫(yī)院臨床研究所動物室屏障系統(tǒng)飼養(yǎng),實驗動物室許可證號:SYXK(京)2010-0011。補腎方藥采用龜鹿二仙湯,組成:龜板膠9g,鹿角膠6g,人參9g,枸杞9g,常規(guī)水煎制,含量為3.04g生藥/kg,給藥濃度為0.304g/mL。健脾方藥采用四君子湯,組成:人參9g,茯苓9g,白術(shù)9g,甘草6g,常規(guī)水煎制,含量為3.04g生藥/kg,給藥濃度為0.304g/mL。補腎健脾方藥采用龜鹿二仙湯合四君子湯,組成:龜板膠9g,鹿角膠6g,人參9g,枸杞9g,茯苓9g,白術(shù)9g,甘草6g,常規(guī)水煎制,含量為5.26g生藥/kg,給藥濃度為0.526g/mL。己烯雌酚:合肥久聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn)(批號:20100120),規(guī)格:每片1mg,使用時用蒸餾水制成濃度為0.0046mg/mL的混懸液,給藥體積為1mL/100g體質(zhì)量,給藥劑量為0.046mg/kg體質(zhì)量。大黃濃煎液:川大黃,水煎制,濃縮至200%。甲基丙烯酸甲酯由北京益利精細化學(xué)品有限公司生產(chǎn)(批號:20050317);甲基丙烯酸丁酯由北京益利精細化學(xué)品有限公司生產(chǎn)(批號:980716);聚乙二醇400由北京化學(xué)試劑公司生產(chǎn)(批號:050425);苯甲酸甲酯有華北地區(qū)特種化學(xué)試劑開發(fā)中心(天津)生產(chǎn)(批號:980923);過氧化苯甲酰由北京金龍化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)(批號:20000420);N,N-二甲基對甲苯胺(N,N-Dimethyl-p-toluidine)由ALDRICH公司生產(chǎn)(批號:04327MB-235)。Ⅰ液:100mL甲基丙烯酸甲酯+35mL甲基丙烯酸丁酯+5mL苯甲酸甲酯+1.2mL聚乙二醇400;Ⅱ液:Ⅰ液+0.4g干燥過氧化苯甲酰;Ⅲ液:Ⅱ液+0.8g干燥過氧化苯甲酰;戊巴比妥鈉由美國Sigma公司生產(chǎn)(批號:20090305);鹽酸四環(huán)素由美國Amresco公司生產(chǎn)(批號:20090301)。LEICACTR6000顯微鏡:德國Leica公司;LeicaQwin圖像分析儀系統(tǒng):德國Leica公司;冷凍切片機:英國TBS公司;Reicheit-Jung2040切片機:德國。組織前藥劑量設(shè)計選用清潔級健康雌性Wistar大鼠86只,隨機分為3組:正常對照組12只、假手術(shù)組12只、卵巢切除組62只。所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,將卵巢切除組大鼠以45mg/kg劑量的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,腹位固定,行卵巢切除術(shù)。假手術(shù)組只是切除小塊脂肪組織,但不摘除卵巢。術(shù)后10周,將卵巢切除組大鼠隨機分為:脾腎兩虛模型組(12只)、己烯雌酚組(12只)、補腎組(12只)、健脾組(13只)及補腎健脾組(13只)。脾腎兩虛模型組大鼠用大黃濃煎液灌胃,4mL/只,每日1次,連續(xù)14d;同時,其余各組大鼠胃飼等容積的蒸餾水。隨后,己烯雌酚組、補腎組、健脾組及補腎健脾組大鼠分別給予己烯雌酚、補腎方藥、健脾方藥及補腎健脾方藥,每日1次,連續(xù)6d,休息1d,再連續(xù)給藥6d,每周稱重1次,據(jù)此調(diào)整給藥量;同時,脾腎兩虛模型組大鼠給予200%的大黃濃煎液灌胃,每周2次。如此給藥3個月。正常對照組、假手術(shù)組按同法灌服等體積的蒸餾水。處死前16d和前3d分別腹腔注射鹽酸四環(huán)素30mg/kg體質(zhì)量,以對骨進行熒光標(biāo)記。給藥結(jié)束后,取大鼠右側(cè)脛骨近端1/3,制作不脫鈣骨切片,進行骨組織形態(tài)計量學(xué)指標(biāo)的檢測。2.指標(biāo)檢測2.1組織嵌入法n-二甲基法取大鼠右側(cè)脛骨近端1/3,置于4%多聚甲醛溶液(pH值7.4)中固定24h,然后進行脫水,程序為80%乙醇2d,95%乙醇2d,100%乙醇2d,二甲苯2d。接著,標(biāo)本依次在塑料聚合液Ⅰ液、Ⅱ液、Ⅲ液中各浸泡3d。以上固定、脫水和浸泡過程均在4℃進行。最后,將400μLN,N-二甲基對甲苯胺加入到100mL預(yù)冷(4℃)Ⅲ液中,用磁力攪拌器攪拌10min后,在青霉素小瓶中注入約7mL的Ⅲ液,將骨標(biāo)本按同一方向放入瓶底,用注射器抽空包埋瓶中空氣,然后置于-20℃冰箱中聚合1周左右,則可變?yōu)闊o色透明的堅硬包埋塊。修塊后,在Reicheit-Jung2040切片機上,每塊骨組織用鎢鋼刀切出5μm的縱向不脫鈣骨切片各2張。其中1張用于甲苯胺藍染色,另1張用于熒光觀察。2.2骨小梁表面因變質(zhì)trabeculabe用LeicaQwin圖像分析系統(tǒng)進行計量分析:(1)骨量的檢測:用骨小梁體積百分比(percentageoftrabecularbonevolume,TBV%),即骨小梁體積占被測骨髓腔總體積的百分比進行表示,它是衡量骨量水平的主要標(biāo)志。(2)骨吸收情況的檢測:用骨小梁吸收表面百分比(percentageoftrabecularboneresorption,TRS%)表示,即不規(guī)則、凹凸不平的骨小梁表面占骨小梁表面的百分比,它也可以判斷破骨細胞的活性。(3)骨形成情況的檢測:(1)骨小梁形成表面百分比(percentageoftrabecularboneformation,TFS%):有成骨細胞被覆的類骨質(zhì)表面占骨小梁表面的百分比,它也可以判斷成骨細胞的活性;(2)骨小梁礦化率(mineralizationrateoftrabecularbone,MAR):骨小梁表面熒光雙標(biāo)記帶的平均距離除以2次標(biāo)記相隔的天數(shù);(3)類骨質(zhì)平均寬度(widthofosteoid,OSW):皮質(zhì)內(nèi)表面有成骨細胞被覆的類骨質(zhì)的平均寬度;(4)骨皮質(zhì)礦化率(mineralizationrateofcorticalbone,mAR):皮質(zhì)內(nèi)表面熒光雙標(biāo)記帶的平均距離除以2次標(biāo)記相隔的天數(shù)。3.統(tǒng)計方法實驗結(jié)果均以表示,采用方差分析(ANOVA)處理,組間兩兩比較,采用q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。腎兩虛型統(tǒng)一模型大鼠軟骨trs%和tfs%的變化,主要有兩種方法1.補腎法、健脾法和補腎健脾法對脾腎兩虛型骨質(zhì)疏松大鼠脛骨TBV%的影響見表1。脾腎兩虛模型組大鼠脛骨TBV%顯著性低于假手術(shù)組。補腎組、健脾組、補腎健脾組、己烯雌酚組大鼠脛骨TBV%均顯著性高于脾腎兩虛模型組(P<0.05,P<0.01),但明顯低于假手術(shù)組(P<0.01)。與健脾組相比,補腎組及補腎健脾組的TBV%明顯增高,且補腎健脾組的TBV%較補腎組亦有顯著增高(P<0.01)。2.補腎法、健脾法和補腎健脾法對脾腎兩虛型骨質(zhì)疏松大鼠脛骨TRS%和TFS%的影響見表2。與假手術(shù)組相比,脾腎兩虛模型組大鼠脛骨TRS%和TFS%均顯著性增高(P<0.01)。補腎組、健脾組、補腎健脾組、己烯雌酚組大鼠脛骨TRS%和TFS%均顯著低于脾腎兩虛模型組(P<0.01),且補腎健脾組、己烯雌酚組大鼠脛骨TRS%和TFS%相較于假手術(shù)組無明顯差異,但補腎組、健脾組大鼠脛骨TRS%和TFS%仍明顯高于假手術(shù)組。與健脾組相比,補腎組及補腎健脾組的TRS%和TFS%明顯降低(P<0.05,P<0.01),且補腎健脾組的TRS%和TFS%較補腎組降低更為顯著(P<0.05,P<0.01)。3.補腎法、健脾法和補腎健脾法對脾腎兩虛型骨質(zhì)疏松大鼠脛骨OSW、MAR和mAR的影響見表3。脾腎兩虛模型組大鼠脛骨OSW、MAR和mAR較之假手術(shù)組均顯著性增高(P<0.01)。與脾腎兩虛模型組相比,補腎組、健脾組、補腎健脾組、己烯雌酚組大鼠脛骨OSW、MAR和mAR均顯著性降低(P<0.01)。與健脾組及補腎組相比,補腎健脾組的MAR和mAR均明顯降低(P<0.01),但OSW無明顯差異。見表1:腎有機溶劑絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是中老年婦女絕經(jīng)后的一種常見病、多發(fā)病,是由生理性退行變化引起的全身單位體積骨量減少,骨密度降低,易發(fā)生骨折的一種代謝性疾病。中醫(yī)將骨質(zhì)疏松癥歸于“骨痹”或“骨痿”的范疇。中醫(yī)理論認為,“腎為先天之本”,“腎生骨髓”,“其充在骨”。骨的生長、發(fā)育、強勁、衰弱與腎精盛衰關(guān)系密切,腎精充足則骨髓生化有源,骨骼得以滋養(yǎng)而強健有力;腎精虧虛則骨髓生化乏源,骨骼失養(yǎng)而痿弱無力?！鹅`樞·經(jīng)絡(luò)》篇曰:“足少陰氣絕,則骨枯……骨不濡則肉不能著也;骨肉不相親則肉軟卻……發(fā)無澤者骨先死”。從以上論述可以看出,腎虛是引起骨質(zhì)疏松癥的根本原因。以往的研究顯示,腎虛(卵巢切除)可使大鼠的骨量顯著降低,使其骨形成和骨吸收均增高,造成高轉(zhuǎn)換型的骨質(zhì)疏松癥。中醫(yī)認為,“脾為后天之本”。脾主運化,輸布精微,可充養(yǎng)腎精。若脾氣虛弱,中陽不振,精微不布,則腎精乏源,進而使骨髓失養(yǎng)而致骨痿。因此,脾虛可通過導(dǎo)致腎虛進而引起骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示,脾腎兩虛模型組大鼠脛骨TBV%顯著低于假手術(shù)組,而TRS%、TFS%、OSW、MAR和mAR較之假手術(shù)組均顯著增高。同時大鼠表現(xiàn)出毛色不光,食量減少,行為遲緩,喜聚堆,弓背蜷縮,反應(yīng)不靈敏等脾虛的癥狀。說明卵巢切除術(shù)后,再灌胃給予大黃濃煎液14d,即是在腎虛的基礎(chǔ)上疊加了脾虛的因素,可使大鼠的骨量明顯減少,骨轉(zhuǎn)換明顯增高,造成了大鼠脾腎兩虛型骨質(zhì)疏松模型。龜鹿二仙湯,出自《醫(yī)便》,具有滋陰填精,益氣壯陽之功。研究證實,該方對于絕經(jīng)后及老年性骨質(zhì)疏松癥均有較好的治療作用。四君子湯,出自《太平惠民和劑局方》,具有益氣健脾之效,是治療脾胃氣虛證的基礎(chǔ)方,后世眾多補脾益氣的方劑多由此方化裁而來。研究發(fā)現(xiàn),四君子湯對于去卵巢所致的骨質(zhì)疏松癥具有一定的治療作用。龜鹿二仙湯善于溫腎益精,四君子湯長于補脾益氣。將兩方合用,方中鹿角膠甘咸而溫,善于溫腎壯陽,益精補血;龜板膠甘咸而寒,長于填補精髓,滋養(yǎng)陰血,兩者為血肉有情之品,最能峻補陰陽而化生精血;人參善于固氣,氣固則精不遺;枸杞善于滋陰,陰滋則火不泄;白術(shù)苦溫,補氣健脾;茯苓甘淡,健脾滲濕;甘草甘平,和中益土。諸藥合用,脾借腎中陽氣之溫煦得以運化水谷精微;腎精賴水谷精微之滋養(yǎng)得以不斷充實,如此,可達補腎健脾之功效。從中醫(yī)角度來看,對于骨質(zhì)疏松癥的治療,兩方合用,補腎健脾,可取得比單純補腎或單純健脾更好的治療效果。本研究結(jié)果也證實了這一點。與脾腎兩虛模型組相比,補腎組、健脾組、補腎健脾組大鼠脛骨TBV%均顯著增高,TRS%、TFS%、OSW、MAR和mAR均顯著降低。與健脾組相比,補腎組及補腎健脾組的TBV%明顯增高,TRS%和TFS%明顯降低,且補腎健脾組TBV%的增高及TRS%、TFS%、MAR和mAR的降低較補腎組更為明顯。這一結(jié)果說明,補腎法、健脾法以及補腎健脾法對脾腎兩虛型的骨質(zhì)疏松癥均具有治療作用,能增加骨量,降低骨轉(zhuǎn)換率,而3種方法中,補腎法的作用優(yōu)于健脾法,而又以補腎健脾法的療效最佳。這從治療的角度證明了骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生,腎虛是其根本原因,脾虛是主要因素。本研究首次建立了骨質(zhì)疏松癥脾腎兩虛型病證結(jié)合動物模型,并采