第12章 吸光光度法

第12章吸光光度法12.1概述12.2吸光光度法基本原理12.3分光光度計(jì)12.4顯色反應(yīng)及影響因素12.5光度分析法的設(shè)計(jì)12.6吸光光度法的誤差12.7常用的吸光光度法12.8吸光光度法的應(yīng)用吸光光度法：分子光譜分析法的一種，又稱分光光度法(spectrophotometry)，屬于分子吸收光譜分析方法基于外層電子躍遷12.1概述吸收光譜發(fā)射光譜散射光譜分子光譜原子光譜12.2吸光光度法基本原理1吸收光譜產(chǎn)生的原因光:一種電磁波,波粒二象性

光譜名稱波長(zhǎng)范圍X射線0.1~10nm遠(yuǎn)紫外光10~200nm近紫外光200~400nm可見光400~750nm近紅外光0.75~2.5um中紅外光2.5~5.0um遠(yuǎn)紅外光5.0~1000um微波0.1~100cm無線電波1～1000m當(dāng)光子的能量與分子的

E匹配時(shí)，就會(huì)吸收光子

E=hu=hc/la躍遷類型

價(jià)電子躍遷：σ→σ*,π→π*;n→σ*,n→π*

E(h

)順序:n→π*<π→π*<n→σ*<σ→σ*

有機(jī)化合物的生色原理b生色團(tuán)（chromophore)和助色團(tuán)(auxochrome)

生色團(tuán):含有π→π*躍遷的不飽和基團(tuán)助色團(tuán):含非鍵電子的雜原子基團(tuán),如-NH2,-OH,-CH3…

與生色團(tuán)相連時(shí)，會(huì)使吸收峰紅移(bathochromicshift)，吸收強(qiáng)度增強(qiáng)物質(zhì)的顏色吸收光顏色波長(zhǎng)范圍(l,nm)黃綠黃橙紅紫紅紫藍(lán)綠藍(lán)藍(lán)綠紫藍(lán)綠藍(lán)藍(lán)綠綠黃綠黃橙紅400-450450-480480-490490-500500-560560-580580-600600-650650-7502物質(zhì)顏色和其吸收光關(guān)系互補(bǔ)色吸收光譜曲線：物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下吸收的光的強(qiáng)度大小。

A～l關(guān)系最大吸收波長(zhǎng)lmax：光吸收最大處的波長(zhǎng)3一些基本名詞和概念lmax對(duì)比度(Δl):有色化合物最大吸收波長(zhǎng)(lMRmax)與試劑最大吸收波長(zhǎng)(lRmax)之差Δl原子光譜為線光譜分子光譜為帶光譜電子躍遷能級(jí)分子振動(dòng)能級(jí)分子轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)4朗伯-比爾定律光吸收定律－朗伯-比爾(Lambert-Beer)定律吸光光度法的理論依據(jù)，研究光吸收的最基本定律I0=Ir+It+IaI0=It+IaI0IrItIa

T=It/I0,T:透射比或透光度

A=lg(I0/It)＝lg(1/T),A:吸光度

吸光度(absorbance)、透光率、百分透光率間的關(guān)系有：T=It/I0,T%=T×100，A=-lgT=2-lgT%朗伯定律：光吸收與溶液層厚度成正比比爾定律：光吸收與溶液濃度成正比當(dāng)一束平行單色光垂直照射到樣品溶液時(shí)，溶液的吸光度與溶液的濃度及光程（溶液的厚度）成正比關(guān)系－－－朗伯比爾定律－－－光吸收定律數(shù)學(xué)表達(dá)：A＝lg(1/T)=Kbc其中，A:吸光度，T:透射比(transmitance)，K:比例常數(shù)，b:溶液厚度，c:溶液濃度注意：平行單色光均相介質(zhì)無發(fā)射、散射或光化學(xué)反應(yīng)摩爾吸光系數(shù)eA=e

bcA=Kbcc:mol/Le

表示物質(zhì)的濃度為1mol/L,液層厚度為1cm時(shí)溶液的吸光度。單位：

(L?mol-1?cm-1)c:g/LA=abca:吸光系數(shù)桑德爾(sandell)靈敏度：S當(dāng)儀器檢測(cè)吸光度為0.001時(shí)，單位截面積光程內(nèi)所能檢測(cè)到的吸光物質(zhì)的最低含量。單位：mg/cm2

S=M/e

推導(dǎo)：根據(jù)定義0.001＝εbc故bc＝0.001/ε（1）c為濃度，單位為mol/1000cm3,b為cm,bc表示單位截面積光程內(nèi)的摩爾數(shù)，即mol/1000cm2，如果bc乘以被測(cè)物質(zhì)的分子量M,則得單位截面積光程內(nèi)被測(cè)物質(zhì)的量，即桑德爾靈敏度S。S=（bc/1000）×M×106=bcM×103（μg·cm-2），將（1）的bc＝0.001/ε代入，S＝(0.001/ε)×M×103，得：S=M/ε靈敏度表示方法氯磺酚S測(cè)定鋼中的鈮50ml容量瓶中有Nb30μg，用2cm比色池，在650nm測(cè)定光吸收，A＝0.43,求S.(Nb原子量92.91)。有兩種做法：根據(jù)A=εbC,求ε＝3.3×104L·mol-1·cm-1

吸光度的加和性A1=e1bc1A2=e2bc2A=e1bc1+e2bc2

根據(jù)吸光度的加和性可以進(jìn)行多組分的測(cè)定以及某些化學(xué)反應(yīng)平衡常數(shù)的測(cè)定在某一波長(zhǎng)，溶液中含有對(duì)該波長(zhǎng)的光產(chǎn)生吸收的多種物質(zhì)，那么溶液的總吸光度等于溶液中各個(gè)吸光物質(zhì)的吸光度之和1分光光度計(jì)的組成光源單色器樣品池檢測(cè)器讀出系統(tǒng)12.3分光光度計(jì)常用光源光源波長(zhǎng)范圍(nm)適用于氫燈185~375紫外氘燈185~400紫外鎢燈320~2500可見，近紅外鹵鎢燈250~2000紫外，可見，近紅外氙燈180~1000紫外、可見（熒光）能斯特?zé)?000~3500紅外空心陰極燈特有原子光譜激光光源特有各種譜學(xué)手段單色器作用:產(chǎn)生單色光常用的單色器：棱鏡和光柵樣品池（比色皿）

厚度(光程):0.5,1,2,3,5…cm

材質(zhì)：玻璃比色皿－－可見光區(qū)石英比色皿－－可見、紫外光區(qū)檢測(cè)器

作用：接收透射光，并將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)常用檢測(cè)器：光電管光電倍增管光二極管陣列光電管分為紅敏和紫敏，陰極表面涂銀和氧化銫為紅敏，適用625－1000nm波長(zhǎng)；陰極表面涂銻和銫為紫敏，適用200－625nm波長(zhǎng)目視比色法—比色管光電比色法—光電比色計(jì)

光源、濾光片、比色池、硒光電池、檢流計(jì)分光光度法與分光光度計(jì)722型分光光度計(jì)光學(xué)系統(tǒng)圖1.光源；2.濾光片；3,8聚光鏡4,7.狹縫；5.準(zhǔn)直鏡；6.光柵9.比色池；10.光電管12.4顯色反應(yīng)及影響因素要求：a.選擇性好b.靈敏度高(ε>104)c.產(chǎn)物的化學(xué)組成穩(wěn)定d.化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定e.反應(yīng)和產(chǎn)物有明顯的顏色差別(對(duì)比度

l>60nm)沒有顏色的化合物，需要通過適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)定量生成有色化合物再測(cè)定－－顯色反應(yīng)1顯色反應(yīng)絡(luò)合反應(yīng)氧化還原反應(yīng)2顯色反應(yīng)類型離子締合反應(yīng)成鹽反應(yīng)褪色反應(yīng)

Zr(IV)-偶氮胂III絡(luò)合物測(cè)定草酸吸附顯色反應(yīng)

達(dá)旦黃測(cè)定Mg(II),Mg(OH)2吸附達(dá)旦黃呈紅色3顯色劑無機(jī)顯色劑:過氧化氫，硫氰酸銨，碘化鉀有機(jī)顯色劑：偶氮類：偶氮胂III三苯甲烷類三苯甲烷酸性染料鉻天菁S三苯甲烷堿性染料結(jié)晶紫鄰菲羅啉類：新亞銅靈肟類：丁二肟4多元絡(luò)合物混配化合物Nb-5-Br-PADAP-酒石酸V-PAR-H2O離子締合物

AuCl4--羅丹明B金屬離子-配體-表面活性劑體系Mo-水楊基熒光酮-CTMAB5影響因素a溶液酸度（pH值及緩沖溶液）影響顯色劑的平衡濃度及顏色，改變?chǔ)

影響待測(cè)離子的存在狀態(tài)，防止沉淀

影響絡(luò)合物組成形式pHλmax(nm)形式pHλmax(nm)H4L+1.2462-465Sn4+1.0530H3L4.8-5.2462,490Ga3+5.0550H2L-8.4-9.0512HL2-11.4-12.0532-538pH對(duì)苯芴酮及其絡(luò)合物的顏色影響b顯色劑的用量稍過量，處于平臺(tái)區(qū)c顯色反應(yīng)時(shí)間針對(duì)不同顯色反應(yīng)確定顯色時(shí)間反應(yīng)快且產(chǎn)物穩(wěn)定；反應(yīng)快但產(chǎn)物不穩(wěn)定；反應(yīng)慢，穩(wěn)定需時(shí)間；反應(yīng)慢但不穩(wěn)定d顯色反應(yīng)溫度加熱可加快反應(yīng)速度，導(dǎo)致顯色劑或產(chǎn)物分解e溶劑f干擾離子有機(jī)溶劑，提高靈敏度、顯色反應(yīng)速率消除辦法：提高酸度，加入隱蔽劑，改變價(jià)態(tài)選擇合適參比選擇適當(dāng)波長(zhǎng)12.5光度分析法的設(shè)計(jì)1.選擇顯色反應(yīng)2.選擇顯色劑3.優(yōu)化顯色反應(yīng)條件4.選擇檢測(cè)波長(zhǎng)5.選擇合適的濃度6.選擇參比溶液7.建立標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)量條件選擇1測(cè)定波長(zhǎng)選擇選擇原則：“吸收最大，干擾最小”靈敏度選擇性2測(cè)定濃度控制控制濃度吸光度A：0.2～0.8減少測(cè)量誤差3參比溶液選擇儀器調(diào)零消除吸收池壁和溶液對(duì)入射光的反射扣除干擾試劑空白：加入試劑，不加試樣試樣空白：加入試樣，不加試劑（試樣有吸收）褪色空白：試樣中加入某物質(zhì)，使待測(cè)組分與之作用，然后加入試劑，以此為參比。4標(biāo)準(zhǔn)曲線制作理論基礎(chǔ)：朗伯-比爾定律相同條件下測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度AA～c作圖12.6吸光光度法的誤差非單色光引起的偏移物理化學(xué)因素：非均勻介質(zhì)及化學(xué)反應(yīng)吸光度測(cè)量的誤差

對(duì)朗伯-比爾定律的偏移1非單色光引起的偏移復(fù)合光由l1和l2組成，對(duì)于濃度不同的溶液a和b,引起的吸光度的偏差不一樣，濃度大，復(fù)合光引起的誤差大，故在高濃度時(shí)線性關(guān)系向下彎曲。*其它光學(xué)方面的干擾

雜散光散射光反射光非平行光非均勻介質(zhì)

膠體，懸浮、乳濁等對(duì)光產(chǎn)生散射，使實(shí)測(cè)吸光度增加，導(dǎo)致線性關(guān)系上彎2物理化學(xué)因素離解、締合、異構(gòu)等如：Cr2O72-+H2O-=2HCrO4-=2H++2CrO42-PAR的偶氮－醌腙式化學(xué)反應(yīng)顯色反應(yīng)體系中的副反應(yīng)影響M+nL=MLn顯色反應(yīng)*其它離子可能與顯色劑反應(yīng)：M′+nL=M′Ln,消耗顯色劑；*L受酸效應(yīng)影響，有L-、HL+等形態(tài)存在；被測(cè)離子有絡(luò)合效應(yīng)。條件穩(wěn)定常數(shù)：通常被測(cè)離子有99％以上絡(luò)合時(shí)，可以認(rèn)為反應(yīng)完全，此時(shí)這個(gè)式子可以判斷不同條件下顯色反應(yīng)的完全程度吸光度標(biāo)尺刻度不均勻3吸光度測(cè)量的誤差A(yù)＝0.434

，T＝36.8%時(shí)，測(cè)量的相對(duì)誤差最小A=0.2~0.8,T=15~65%，相對(duì)誤差<4%

dc/c=dA/A=dT/TlnTEr=dc/c×100％=dA/A×100％=dT/TlnT×100％1.示差吸光光度法目的：提高光度分析的準(zhǔn)確度和精密度解決高(低)濃度組分(i.e.A在0.2~0.8以外)問題分類：高吸光度差示法、低吸光度差示法、 精密差示吸光度法特點(diǎn)：以標(biāo)準(zhǔn)溶液作空白原理：A相對(duì)=

A=bcx-bc0=bc準(zhǔn)確度：讀數(shù)標(biāo)尺擴(kuò)展,相對(duì)誤差減少,

c0愈接近c(diǎn)x,準(zhǔn)確度提高愈顯著12.7常用的吸光光度法例：硫脲還原－硫氰酸鹽比色法測(cè)定鋼鐵中的鉬。酸溶，硫酸－高氯酸介質(zhì)中，硫脲還原鐵（III）為鐵(II),除干擾，還原鉬（VI）