總皂苷提取分離工藝的研究

總皂苷提取分離工藝的研究

ektomykorriza經(jīng)常出現(xiàn)。對(duì)于具有消腫止痛、祛風(fēng)除濕、活血化瘀、腫瘤等作用的中藥總糖苷，通常提取、分離和提取的乙醇在60%-70%之間的酒精中加熱和回流。但正丁醇沸點(diǎn)高、回收難,整個(gè)操作過(guò)程繁瑣費(fèi)時(shí)、成本高,加上有乳化等因素常導(dǎo)致萃取效率較低,而中草藥本身總皂苷含量較低,上述方法難以進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。大孔吸附樹(shù)脂分離、純化中草藥有效成分優(yōu)勢(shì)顯著。用大孔樹(shù)脂分離、純化總皂苷,可很好地解決溶劑法提取皂苷時(shí)遇到的這些問(wèn)題。目前,用大孔樹(shù)脂分離、純化菝葜總皂苷的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以總皂苷吸附量和解吸率為指標(biāo),篩選了4種植化分離中常用的樹(shù)脂,并研究其吸附與解吸優(yōu)化條件,發(fā)現(xiàn)HPD100樹(shù)脂能很好地分離、純化菝葜總皂苷,且該方法具有操作簡(jiǎn)單,周期短的優(yōu)點(diǎn)。1總皂苷樹(shù)的藥物和樹(shù)脂7500紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司,德國(guó)PE公司生產(chǎn))。菝葜根莖,產(chǎn)于湖南邵陽(yáng)地區(qū),粉碎干燥備用;香草醛,高氯酸,冰醋酸,氫氧化鈉和甲醇,均為分析純;正丁醇和乙醇為化學(xué)純;甾體總皂苷對(duì)照品(含量95%,中國(guó)藥品生物制品檢定所)。HPD100,300,6003種大孔樹(shù)脂(滄州寶恩化工有限公司),D101大孔樹(shù)脂(天津南開(kāi)大學(xué)化工廠(chǎng)),樹(shù)脂柱(玻璃柱4根,3cm×30cm)。吸附液(原料液)為本實(shí)驗(yàn)室提取的濃縮液。2樹(shù)脂篩選2.1線(xiàn)性關(guān)系考察精密稱(chēng)取甾體總皂苷對(duì)照品,用甲醇配成248μg·mL-1的對(duì)照品溶液,分別精密吸取0.10,0.15,0.20,0.25,0.30,0.35,0.40mL對(duì)照品溶液及0.40mL甲醇于8支10mL試管中,于70℃恒溫水浴鍋上蒸干,各試管再分別加入0.20mL的5%香草醛冰醋酸溶液及0.80mL高氯酸,搖勻后置于70℃恒溫水浴鍋中保溫15min,取出迅速加入4mL冰醋酸搖勻,在462nm處測(cè)定吸光度,以加甲醇管為空白對(duì)照,以濃度(C)對(duì)A回歸,得回歸方程:A=0.0181C-0.0043,r=0.999,樣品在5~20μg·mL-1線(xiàn)性良好。2.2準(zhǔn)備仔細(xì)量取已充分溶脹的4種樹(shù)脂各16mL,分別裝柱,按常規(guī)方法對(duì)樹(shù)脂進(jìn)行預(yù)處理,洗脫液為70%乙醇。2.3規(guī)定受附液吸附流速一般為4~6BV(樹(shù)脂床層體積)·h-1,解吸流速為其1/2。以平均流速5BV·h-1,自上而下分別通過(guò)吸附液。再以100mL蒸餾水以平均流速5BV·h-1洗柱,洗脫未被吸附的皂苷及雜質(zhì),對(duì)吸附原料液和4根樹(shù)脂柱流出液(包括水洗液)分別取樣,以備測(cè)定。2.4解吸以平均2.5BV·h-1的流速,以200mL70%乙醇解吸液洗脫4根吸附量確定的樹(shù)脂柱。收集解吸洗脫液備測(cè)。2.5總皂苷濃度測(cè)定吸附液、收集的各柱吸附流出液(包括水洗液)及解吸洗脫液,分別在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓真空回收至干,再加20mL熱水溶解,以正丁醇120mL,分3次萃取,合并正丁醇液,在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓真空回收至干,再用甲醇定容到50mL,從中取1mL用甲醇稀釋、定容到10mL,吸取0.20mL稀釋液,按總皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備項(xiàng)下測(cè)其吸光度,根據(jù)回歸方程計(jì)算其濃度。2.6不同樹(shù)脂吸附的單種成分配比依次按下面公式分別計(jì)算各樹(shù)脂的吸附量及解吸率,結(jié)果見(jiàn)表1。吸附量(Q)=原料液濃度×原料液體積-流出液濃度×流出液體積濕樹(shù)脂體積(Q)=原料液濃度×原料液體積?流出液濃度×流出液體積濕樹(shù)脂體積解吸率(α)=解吸液中總皂苷含量(mg)吸附量(mg)×100%(α)=解吸液中總皂苷含量(mg)吸附量(mg)×100%從表中數(shù)據(jù)可以看出,HPD100樹(shù)脂的吸附量與其他樹(shù)脂的吸附量差別不大,但其解吸率高于其他樹(shù)脂的解吸率,故選擇這種非極性大孔吸附樹(shù)脂。3溫度和流速的影響一般認(rèn)為影響吸附效率的主要因素有吸附液濃度、鹽離子濃度、吸附液流速及吸附溫度。對(duì)于實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程,通常的溫度變化對(duì)吸附效果影響不大,實(shí)際吸附過(guò)程的溫度控制也不易實(shí)施。對(duì)于流速,常規(guī)是較低的流速有利于吸附與解吸,但生產(chǎn)率低,故取中間值5BV·h-1為吸附流速。本實(shí)驗(yàn)只就吸附液的pH、添加NaCl的濃度對(duì)吸附效率的影響進(jìn)行實(shí)驗(yàn)考察與優(yōu)化。3.1柱內(nèi)柱吸附量的測(cè)定仔細(xì)量取經(jīng)預(yù)處理的HPD100樹(shù)脂64mL,分成4等份,分別裝入4根玻璃柱中,以10%HCl溶液將各等分原料液的pH值分別調(diào)為4.0,5.0,6.0,7.0,再分別上柱,流速為5BV·h-1。檢測(cè)原料液的濃度及各柱流出液的量與濃度,計(jì)算各柱吸附量,結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)吸附量隨pH增大而減小,pH為4.0吸附液的吸附量明顯高于其他pH吸附液的吸附量,但與pH為5.0吸附液的吸附量差別不大,因該種樹(shù)脂規(guī)定使用的pH為5.0~8.0,過(guò)低的pH會(huì)影響、甚至破壞樹(shù)脂,故實(shí)際生產(chǎn)中使用的最適pH宜選為5.0。3.2總皂苷的吸附量取pH5.0的吸附液6等份,依次加NaCl使其濃度分別為0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0mol·L-1,其他條件與2.1同,不同NaCl濃度吸附液的吸附量如圖2。從圖2可以看出,NaCl濃度從0.5~1.5mol·L-1,總皂苷吸附量隨NaCl濃度增加而增加,尤其是從1.0~1.5mol·L-1總皂苷吸附量增加十分明顯,兩者之間近乎呈線(xiàn)性關(guān)系。但當(dāng)NaCl濃度大于1.5mol·L-1時(shí),單位體積樹(shù)脂的總皂苷吸附量增加較小,再添加NaCl對(duì)吸附量的影響已經(jīng)很小,故吸附液的NaCl濃度以1.5mol·L-1為宜。因該樹(shù)脂對(duì)Na+,Cl-均不吸附,洗脫前再先經(jīng)水洗后即可徹底除去Na+,Cl-。故添加NaCl,對(duì)于總皂苷純度及活性不會(huì)產(chǎn)生影響。4解吸條件優(yōu)化4.1不同樹(shù)脂柱的解吸實(shí)驗(yàn)從經(jīng)濟(jì)及環(huán)境的角度考慮,作者在此僅選擇乙醇與水作為洗脫劑,比較不同乙醇濃度的解吸效果。用去離子水將95%乙醇分別調(diào)成含乙醇40%,50%,60%,70%,80%,90%濃度的溶液,再分別解吸同樣條件(pH5.0,NaCl濃度1.5mol·L-1)吸附飽和的6根樹(shù)脂柱,流速均為2.5BV·h-1,其解吸率見(jiàn)圖3。圖3表明,解吸率隨乙醇濃度增大而增大,但乙醇濃度超過(guò)70%以后,其解吸率增加很小,用80%乙醇比用70%乙醇增加的值較小,影響不明顯,而增加乙醇濃度會(huì)洗脫更多的雜質(zhì),例如色素、樹(shù)脂等,降低總皂苷純度,所以宜選用70%乙醇為洗脫液。4.2堿減量法考察總皂苷純度70%乙醇的解吸效果用10%的NaOH溶液,將4等份的70%乙醇洗脫液依次調(diào)pH為7.0,8.0,9.0,10.0,進(jìn)行脫附效果比較實(shí)驗(yàn)(其中70%乙醇洗脫液本身的pH為7.0,70%乙醇即為pH7.0的解吸液,不需要再用10%NaOH溶液調(diào)pH,即加0mL的NaOH溶液即可),解吸同樣條件(pH5.0,NaCl濃度1.5mol·L-1)吸附飽和的4根樹(shù)脂柱,流速均為2.5BV·h-1,其解吸率見(jiàn)圖4;洗脫液顏色依次為亮黃色,棕色透明,棕紅色不透明、有沉淀,黑紅色不透明、多沉淀。圖4結(jié)果表明,洗脫液的pH愈高,其解吸率也愈高,但從洗脫液的顏色及沉淀多少可以看出,pH愈高,洗脫的雜質(zhì)及色素也愈多,隨著pH增加,同時(shí)帶來(lái)了更多的、本應(yīng)該需要除去的雜質(zhì)及色素等。雜質(zhì)過(guò)多必然嚴(yán)重影響總皂苷純度,而且堿度過(guò)大,又可能對(duì)工藝設(shè)備、樹(shù)脂及總皂苷產(chǎn)品造成不同程度的損害。從圖4可見(jiàn),pH為7.0與8.0時(shí),兩者解吸率差別也不大,而且pH為7.0時(shí)洗脫液的顏色較淺、透明,提示其雜質(zhì)、色素較少,故綜合考慮,pH還是以7.0為宜。5總皂苷的吸附和解吸性能本研究從4種大孔吸附樹(shù)脂中篩選出的HPD100非極性樹(shù)脂,在室溫、吸附液pH為5.0,NaCl濃度為1.5mol·L-1和