多烯磷脂酰膽堿脂質(zhì)納米粒的研制

多烯磷脂酰膽堿脂質(zhì)納米粒的研制

多烯脂肪（ppc）是從大豆中提取的磷脂，主要活性成分為多烯脂肪二羧酸。其主要藥理作用除了能對已損傷的肝細胞膜進行生理性修復外,還具有減少氧應激與脂質(zhì)過氧化、抑制肝細胞凋亡、降低炎癥反應和抑制肝星狀細胞活化等功能,可從多方面保護肝細胞免受損害,且安全無毒。臨床上常用其注射劑和膠囊,但藥物在肝臟中的分布不高。而脂質(zhì)納米粒作為藥物載體具有,選擇性地靶向分布于網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞豐富的組織和器官中,提高藥物在這些部位的治療濃度的優(yōu)點。因此,選用可靜脈注射用的大豆油作為脂質(zhì)載體,采用熔融乳化-高壓勻質(zhì)法制備了具有被動肝靶向性的多烯磷脂酰膽堿脂質(zhì)納米粒(PPC-LN),并將其制備成穩(wěn)定性良好的凍干粉針劑,為進一步的研究打下基礎。1實驗部分1.1儀器、試劑和標準品EmulsiFlex-C5高壓乳勻機(加拿大Avestin);2690-996高效液相色譜儀(美國Waters);JEM-100SX型透射電子顯微鏡(日本Hitachi);ZetasizerNanoZS90激光粒度分析儀(英國Malvern);JY92-11型超聲波細胞粉碎機(寧波新芝科學儀器研究所);L8-80型超速冷凍離心機(美國Beckman);Modulyo-D冷凍干燥機(美國熱電)。多烯磷脂酰膽堿(上海東尚實業(yè)有限公司,批號:110025-1);多烯磷脂酰膽堿標準品(Sigma公司,批號:025K5204);大豆油(鐵嶺北亞藥用油有限公司);其余試劑為國產(chǎn)分析純或色譜純。1.2方法和結果1.2.1多烯磷脂酰膽的超聲分散制備在預實驗的基礎上,采用熔融乳化-高壓勻質(zhì)法制備PPC-LN。取處方量的多烯磷脂酰膽堿,加熱溶于適量無水乙醇后與大豆油混勻,減壓旋轉蒸發(fā)除去無水乙醇,70℃水浴條件下攪拌加入相同溫度的F68水溶液,以探頭超聲儀進行超聲分散制得初乳,高壓乳勻后即得脂質(zhì)納米?；鞈乙?。1.2.2超聲溫度和時間對粒徑及pdi的影響以粒徑為指標,初步考察了制備工藝中影響粒徑的主要因素。結果發(fā)現(xiàn),PPC與大豆油比例對粒徑影響較大,二者比例為1:1時可得粒徑和分散系數(shù)(PDI)均較小的納米粒。F68的乳化效果較好。由于多烯磷脂酰膽堿與大豆油混合后的熔點在50℃～60℃,而操作溫度應高于此值,故確定最佳加熱溫度為75℃±5℃。制備初乳時,探頭超聲的時間和功率對粒徑的影響較大。固定超聲時間為5s×10次,考察50、100、200、400、800W超聲制得的納米粒,結果發(fā)現(xiàn)超聲功率高于400W時,粒徑并不隨其增加而減小。在相同循環(huán)次數(shù)的壓力下,考察高壓均質(zhì)在5×103、1×104、1.5×103、2×104kPa壓力下的粒徑及PDI。壓力取1.5×103kPa時,粒徑在所要求的范圍內(nèi),且粒徑分布均勻,循環(huán)次數(shù)取5次為佳。1.2.3大豆油-ppc的制備工藝在單因素考察的基礎上,篩選出對PPC-LN粒徑、PDI有較顯著影響的3個因素:即大豆油與PPC的比例(A)、F68濃度(B)、超聲功率(C)。以粒徑、PDI為評價指標,采用3因素3水平正交設計優(yōu)化處方工藝,因素水平見表1,實驗結果見表2。根據(jù)實驗結果可知,影響納米粒粒徑因素的次序為A>B>C,最優(yōu)組合為A2B3C2;影響PDI因素的次序為A>B>C,最優(yōu)組合為A1B1C1。由此可見,兩種指標優(yōu)化的條件不完全一致,但應兼顧。對于因素A,Ⅰy和Ⅱy差異很小,而Ⅰx和Ⅱx差異很大,選擇A2粒徑較小;對于因素B,考慮到不同水平對粒徑影響不大,而PDI變化明顯,選擇B1;因素C對粒徑和PDI影響都不大,故選擇最小功率C1。最終優(yōu)化處方工藝為A2B1C1,即大豆油-PPC(1:1),加入的F68水溶液的濃度為0.5%,超聲功率50W。按此優(yōu)化條件制備出3批樣品,納米粒粒徑和PDI均較為理想。1.2.4凍干前后脂質(zhì)納米粒的培養(yǎng)為了提高PPC脂質(zhì)納米粒制劑的穩(wěn)定性,可添加適當?shù)膬龈杀Ｗo劑制備凍干粉針。經(jīng)篩選,選擇5%羥丙基-β-CD和5%葡萄糖作為凍干保護劑凍干前后脂質(zhì)納米粒的粒徑和PDI幾乎無變化。將5%羥丙基-β-CD和5%葡萄糖攪拌溶解于PPC-LN混懸液中,0.22μm微孔濾膜過濾后分裝,-45℃預凍過夜,凍干,即得。1.2.5透射電鏡觀察樣品凍干后呈完整的白色餅狀。取PPC-LN凍干粉加適量蒸餾水復溶,稀釋,滴加在覆蓋碳膜的銅網(wǎng)上,用2.0%磷鎢酸鈉負染液染色,拍攝透射電鏡照片,觀察形態(tài)。PPC-LN的透射電鏡觀察表明,外觀呈類球形,分布較均勻。1.2.6《漢武學》第5頁“有上界”取3批PPC-LN凍干粉,加適量蒸餾水復溶,稀釋。用激光粒度分析儀測得PPC-LN的平均粒徑為135±12nm,PDI為0.169±0.004,ξ電位為-0.27±0.4mV。1.2.7標準曲線方程采用HPLC法測定PPC的含量。色譜柱為AlltimaSilica(250mm×4.6mm,5μm);流動相為異丙醇-正己烷-水(105:22:32);流速1.0ml·min-1;柱溫30℃±1℃;檢測波長205nm;進樣量10μl。在選定色譜條件下,PPC0.25～2.00mg·ml-1的線性關系良好,標準曲線方程為:Y=4.2496×106X+1.7844×105(r=0.9997)。低、中、高濃度的RSD分別為0.71%、1.30%、1.94%;日內(nèi)和日間RSD分別為1.32%、1.08%(n=5),表明日內(nèi)、日間的精密度均良好。1.2.8游離多烯磷脂酰采用品溶液利用低溫超速離心法分離PPC-LN和游離藥物,測定其包封率。取4.0ml凍干復溶后的PPC-LN,4℃條件下,以5×104r·min-1離心2h,取下部澄清液,以流動相稀釋10倍后作為游離多烯磷脂酰膽堿供試品溶液;另取0.1ml凍干復溶后的PPC-LN,用流動相溶解并定容至10ml,作為總多烯磷脂酰膽堿供試品溶液,采用HPLC法分別測定各供試品中PPC的含量,并計算包封率。測得3批供試品的包封率分別為98.4%、97.8%、96.0%,平均為97.4%。2熱模混懸液由于表面活性劑的作用和納米級的粒徑分布,PPC-LN具有較