帕羅西汀對(duì)應(yīng)激大鼠的長期影響

帕羅西汀對(duì)應(yīng)激大鼠的長期影響

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人類競爭意識(shí)的增強(qiáng)，工作和生活秩序的不斷加快，對(duì)人類的傷害也在加劇。應(yīng)激與病毒感染、消化性潰瘍、心血管、神經(jīng)精神、生殖內(nèi)分泌等系統(tǒng)以及腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。帕羅西汀(paroxetine,商品名賽樂特,Seroxat)是一種選擇性5-HT再攝取抑制劑(SSRI),臨床上廣泛用于各種精神障礙疾病。隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入,基因水平研究精神藥理的報(bào)道越來越多,但國內(nèi)外學(xué)者對(duì)帕羅西汀作用機(jī)制研究仍局限在神經(jīng)遞質(zhì)與受體的水平。為了探討帕羅西汀在基因水平的藥理治療作用機(jī)制,通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究觀察帕羅西汀對(duì)應(yīng)激大鼠行為和下丘腦c-fos基因表達(dá)的影響。1材料和方法1.1鹽酸帕羅西汀溶液fos檢測免疫組化試劑盒:購于北京中山生物技術(shù)有限公司。鹽酸帕羅西汀:白色粉末狀可溶于水,批號(hào):9901136,由上海葛蘭素史克公司提供,溶于蒸餾水配制成所需濃度,ip,體積為1ml·kg-1。大鼠行為測定儀:自制。1.2動(dòng)物籠養(yǎng)實(shí)驗(yàn)清潔級(jí)SD大鼠24只,雌性,7～8周齡,180～200g,Open-Field法評(píng)分相近,由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證號(hào):浙醫(yī)字第220030002)。將大鼠置于室溫21～23℃、相對(duì)濕度45%、12h晝夜周期的動(dòng)物室內(nèi)籠養(yǎng),每籠4只,自由進(jìn)食、飲水。將大鼠隨機(jī)分為3組:正常對(duì)照組、束縛應(yīng)激組、鹽酸帕羅西汀組,每組8只。1.3大鼠在限制期間表型實(shí)驗(yàn)前,動(dòng)物先在實(shí)驗(yàn)室條件下適應(yīng)至少1周。每天上午8ue5fe00將造模大鼠置于特制的限制器內(nèi),每日1次,每次2h,造模大鼠在限制期間禁食,禁水,連續(xù)6d后處死,正常對(duì)照組在同一時(shí)間也禁食,禁水。每天上午8ue5fe00～9ue5fe00,正常對(duì)照組和鹽酸帕羅西汀組大鼠腹腔注射(ip)等量的蒸餾水,鹽酸帕羅西汀組大鼠ip鹽酸帕羅西汀1ml·kg-1,連續(xù)6d。1.4觀察指標(biāo)及其度量Open-Field法測定行為。本實(shí)驗(yàn)所用敞箱高40cm,長、寬為100cm,周壁為黑色,底面按分成面積相等的25格(20cm×20cm)沿墻格稱為外周格,其余為中央格。采用單盲法,設(shè)兩位觀察者,分別觀察不同指標(biāo)。以動(dòng)物穿越底面格數(shù)為水平活動(dòng)(crossing)得分,動(dòng)物一般靠邊行走,穿越1格為1次(3爪以上跨入鄰格的次數(shù)),以直立次數(shù)為垂直活動(dòng)(rearing)得分,動(dòng)物雙足離開底面為垂直活動(dòng),無論動(dòng)物站立多長時(shí)間直至動(dòng)物雙足放下為一次活動(dòng)。每只動(dòng)物每次僅進(jìn)行1次測定,每次測定時(shí)間為3min。1.5無砂藥物在10%水合氯醛(3ml·kg-1)麻醉下,經(jīng)左心室至升主動(dòng)脈插管,先快灌流0.9%氯化鈉溶液100～150ml,再慢灌注含4℃的4%多聚甲醛0.1mol·L-1磷酸緩沖液100ml。立即取腦后固定于4%多聚甲醛中24h,再移至20%蔗糖磷酸緩沖液中過夜(4℃)至腦組織塊沉底,次日連續(xù)冠狀冰凍切片,切片厚30μm。取含下丘腦最大斷面的切片(參照?qǐng)D譜TheFourthEditionofTheRatBraininStereotaxicCoordinates),收集于0.01mol·L-1的PBS緩沖液中。1.6抗兔igg抗體-hrp的制備采用SP二步法:用多聚賴氨酸處理過的玻片撈片,置60℃烤箱烤30min,以使切片緊密粘附,依次以下步驟:3%過氧化氫孵育5min,以阻斷內(nèi)源性過氧化酶。滴加兔來源的c-fos1ue5fe100,30～50μl,室溫孵育90min。滴加山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體50μl,室溫孵育20min。應(yīng)用DAB溶液顯色(雙蒸水1ml,A:50μl,B:50μl,避光保存,30min用完),在顯微鏡下觀察。蒸餾水沖洗。蘇木素復(fù)染。蒸餾水沖洗。脫水:70%酒精1次,75%酒精1次,95%酒精2次,無水酒精2次,2-甲苯2次,各3min。中性樹膠封片。上述每步驟間均采用PBS充分洗滌。對(duì)照實(shí)驗(yàn)取部分切片用0.01mol·L-1PBS液代替兔來源的一抗進(jìn)行孵育,其余步驟相同。1.7免疫陽性神經(jīng)元記數(shù)用HPLAS1000高分辨彩色病理圖文分析系統(tǒng)行Fos樣免疫陽性神經(jīng)元記數(shù)。所有切片均在同一光強(qiáng)度下、同一放大倍數(shù)(×400)下分析。觀察每只鼠含有室旁核神經(jīng)元的所有切片,以最高密度切片為代表,測定每個(gè)視野內(nèi)Fos樣免疫陽性細(xì)胞數(shù)。1.8c-fos陽性細(xì)胞密度檢測應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。用c-fos陽性細(xì)胞數(shù)占該切片觀察細(xì)胞總數(shù)的百分率為定量標(biāo)準(zhǔn),表示c-fos陽性細(xì)胞密度,數(shù)據(jù)以xˉxˉ±s表示,行方差分析處理,P<0.05為差異有顯著性。2結(jié)果2.1應(yīng)激組大鼠的焦慮及焦慮癥狀情況與正常對(duì)照組相比,各組在應(yīng)激后d6水平活動(dòng)和垂直活動(dòng)次數(shù)顯著增加(P<0.05),應(yīng)激組大鼠的活動(dòng)明顯增加,表現(xiàn)為焦慮癥狀。鹽酸帕羅西汀組較應(yīng)激組相兩種運(yùn)動(dòng)次數(shù)有顯著減少(P<0.05,表1),帕羅西汀連續(xù)給藥能減少應(yīng)激大鼠的活動(dòng)次數(shù)。2.2大鼠腦出血后c-fos表達(dá)情況光鏡下觀察,DAB顯色的免疫反應(yīng)終產(chǎn)物Fos呈棕黃色顆粒狀,位于神經(jīng)細(xì)胞核內(nèi)。正常對(duì)照組大鼠下丘腦內(nèi)無c-fos表達(dá)陽性細(xì)胞,其余各組下丘腦內(nèi)均有c-fos不同程度的表達(dá)(圖1),以室旁核最為密集,鹽酸帕羅西汀組大鼠下丘腦室旁核c-fos表達(dá)陽性細(xì)胞神經(jīng)元數(shù)目顯著減少,Fos陽性細(xì)胞百分率為11.5±1.4,顯著低于束縛應(yīng)激組61.4±4.2(P<0.05)。3應(yīng)激-c-fos的表達(dá)與腦功能曠場反應(yīng)(openfield)是研究動(dòng)物恐懼、緊張情緒的重要指標(biāo)。水平活動(dòng)反映動(dòng)物的活動(dòng)度,垂直活動(dòng)反映動(dòng)物對(duì)周圍環(huán)境的不確定性和對(duì)周圍環(huán)境中可能存在的危險(xiǎn)性的觀察。本研究通過束縛對(duì)大鼠產(chǎn)生心理應(yīng)激反應(yīng)的模型的研究發(fā)現(xiàn)各心理應(yīng)激實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M的大鼠在曠場中穿行格數(shù)和直立次數(shù)明顯增加,表明大鼠自發(fā)行為和探究活動(dòng)增加,中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性增強(qiáng),進(jìn)而呈現(xiàn)早期的焦慮癥狀。本研究對(duì)應(yīng)激鼠連續(xù)6d給予帕羅西汀(1mg·kg-1),發(fā)現(xiàn)鹽酸帕羅西汀組大鼠在曠場中穿行格數(shù)和直立次數(shù)明顯下降,同國內(nèi)外臨床研究相一致,表明帕羅西汀能抑制大鼠的焦慮行為。c-fos基因是即刻早期基因家族的一員。近年來,用心理應(yīng)激源作為刺激,以即刻早期基因c-fos的表達(dá)作為腦功能性示蹤的“標(biāo)志”,對(duì)心理應(yīng)激的腦機(jī)制進(jìn)行了較深入的研究。神經(jīng)元c-fos的表達(dá),一方面具有普遍性,幾乎任何形式的刺激只要達(dá)到一定的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間,都可以引起中樞c-fos的表達(dá);另一方面又呈現(xiàn)出內(nèi)在的特異性,不同形式的刺激,誘導(dǎo)c-fos表達(dá)的中樞部位不同。反復(fù)同一形式的刺激可產(chǎn)生中樞c-fos表達(dá)的“耐受性”或“習(xí)慣化”。并且不同形式的刺激引起中樞c-fos的表達(dá),相互之間存在“交叉耐藥”。本實(shí)驗(yàn)大鼠對(duì)腹腔注射,抓捉等應(yīng)激刺激產(chǎn)生適應(yīng)性,排除了這些應(yīng)激刺激對(duì)c-fos的誘導(dǎo)作用。本實(shí)驗(yàn)束縛應(yīng)激大鼠下丘腦室旁核FLI神經(jīng)元數(shù)目明顯增加,說明應(yīng)激可以誘導(dǎo)下丘腦室旁核c-fos的表達(dá),下丘腦參與了應(yīng)激的調(diào)控。本研究在連續(xù)給藥過程中,發(fā)現(xiàn)帕羅西汀連續(xù)6d給藥可減少束縛應(yīng)激大鼠