阿霉素復合磷脂毫微粒的研制

阿霉素復合磷脂毫微粒的研制實習生 韓勇指導老師 陳鷹

摘要目的：制備穩(wěn)定性好，親和力強的阿霉素復合磷脂毫微粒。方法：采用均勻設計等方法篩選處方和工藝。先制備阿霉素聚氰基丙烯酸正丁酯毫微粒，再將其用磷脂雙分子層包裹，得到阿霉素復合磷脂毫微粒。結果：制得的復合磷脂毫微粒的平均包封率為86.65%±0.97，平均粒徑為256.2nm。穩(wěn)定性較普通脂質體要好，包封率比普通毫微粒要大。結論：阿霉素復合磷脂毫微粒達到設計要求，該制劑有望成為一種新的藥物靶向載體系統(tǒng)。關鍵詞阿霉素復合磷脂毫微粒均勻設計法包封率穩(wěn)定性

STUDIESOFADRIAMYCINCOMPOUNDLIPOSOMALNANOPARTICLESHanYong*ChenYing(WuhanGeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommand,*StudentonGraduate’2000inthePharmacyCollegeofHuazhongScienceandTechnologyUniversity)AbstractObjective:ToprepareAdriamycinCompoundLiposomalNanoparticleswithgoodstabilityandstrongaffinity.Methods:Usingevendesignmethodtooptimizetherecipeandtechnology.Atfirst,AdriamycinPolybutylcyanoacrylatenanoparticleswasprepared.ThenAdriamycinCompoundLiposomalNanoparticles.Results:TheaverageenvelopingrateofthepreparedCompoundLiposomalNanoparticlesis86.65%±0.97(n=3),theaverageparticlesizeis256.2nm.Thestabilityisbetterthanthatofcommonliposomes.Theenvelopingrateislargerthanthatofcommonnanoparcles.Conclusions:AdriamycinCompoundLiposomalNanoparticlesisconsistentwiththedesigningsupposition.Thispreparationisexpectedtobecomeanewdrugtargetingcarriersystem.Keywords:AdriamycinCompoundLiposomalNanoparticlesEven-designmethodEnvelopingrateStability

毫微粒（Nanoparticles，NP）系利用天然高分子或合成的化學物質為載體制成的載藥微粒[1]。其活性成分溶解、包封、吸附或連接在載體粒子上形成帶乳光的膠體分散系統(tǒng)，粒子大小在10-1000nm之間，具有緩釋性，穩(wěn)定性較好，可生物降解性和一定的生物組織靶向性及負載量大等特點，是一種良好的抗癌藥物載體，但作為NP的材料中的某些聚合物對人體有一定抗原性，而且有的并非藥用輔料，進入人體可能會產生不良影響。 脂質體（Liposome）是將藥物包封于類脂雙分子層形成的薄膜中間所制成的超微型球狀載體制劑。具有組織親和力強、可生物降解、無毒性及靶向性等特點。但脂質體穩(wěn)定性較差，進入人體后因血中酶及蛋白的作用易破裂使藥物漏出，又易被網狀內皮系統(tǒng)識別吞噬，縮短藥物在體內的停留時間而降低療效。 阿霉素（Adriamycin,ADM）作為目前肝癌化療的首選藥物之一，臨床上直接用于病人對其心臟及造血系統(tǒng)等毒性大，國內外已有不少人將其制成單獨的脂質體或毫微粒以增強其定向輸送，減小用藥量和毒副作用。本文在前人研究的基礎上，考慮到NP具有緩釋性、穩(wěn)定性好，以及脂質體具有親和力強、無毒性的優(yōu)點，為此，我們將兩者結合起來，進行了如下的探索性研究，即首先制備阿霉素聚氰基丙烯酸正丁酯毫微粒，再將其用磷脂雙分子層包裹，最后得到兼具兩者優(yōu)勢的阿霉素復合磷脂毫微粒，該制劑有可能成為一種新的藥物靶向載體系統(tǒng)。1．

藥品與儀器1．

1藥品：鹽酸阿霉素（原料藥，深圳萬樂制藥有限公司,批號:xc-044），膽固醇（北京海淀區(qū)微生物培養(yǎng)基制品廠），磷脂（進口分裝，注射用），α-氰基丙烯酸正丁酯，磷酸緩沖液（PBS，PH＝5.0），SephadexG-50（上海腦海生物科技公司），右旋糖酐70、吐溫-80為藥用規(guī)格，乙醚、二甲基亞砜（DMSO）等試劑為分析純。2．

2儀器：DF-101B型集熱式恒溫磁力攪拌器（浙江樂清市樂成電器廠）,RE-52A型旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）,SHZ-D型循環(huán)水式真空泵（河南鞏義市英峪儀器廠）,KT-300Y型超聲波藥品處理機（濟寧中冠超聲波有限責任公司）,JY92-2D型超聲波探頭式粉碎機（寧波新芝科技研究所）,電鏡（HITACHIH-300）,UV-260紫外分光光度計（日本島津）,電光分析天平（上海天平儀器廠）。1．

方法與結果2．1處方篩選與制備2．1．1阿霉素毫微粒（產品A）的制備： 因產品A的制備方法及配方無詳細報道，故只能通過實驗摸索。根據預試驗結果并參考有關文獻[2]，采用均勻設計的方法設計圖表，見表1,按U9（94）安排試驗，見表2。表1 因素與水平水平因素X1X2X3X4(mg)1a50%32a5.50.2%43a5.50.4%54b60.6%75b6.50.8%96b71.0%127c7.51.2%158c81.5%179c8.52%25其中X1為制備方法：a法：在磁力攪拌下，將含右旋糖酐、吐溫、ADM并調節(jié)PH值的10ml水溶液注入到PBCA中，繼續(xù)攪拌2hr，過0.45μm濾膜除去大粒徑粒子，即得。b法：將ADM和PBCA溶于丙酮－甲醇－三乙胺（4：3：1）混合溶劑中，磁力攪拌下，用細針頭注入含Tween－80和右旋糖酐的10ml水中,攪拌2hr，再用真空水泵抽去有機溶劑，過0.45μm濾膜除去大粒徑粒子，即得。c法：在磁力攪拌下，將PBCA注入到含右旋糖酐、吐溫、ADM并調節(jié)PH值的10ml水溶液中,繼續(xù)攪拌2hr，過0.45μm濾膜除去大粒徑粒子，即得。X2為PH值，X3為穩(wěn)定劑右旋糖酐用量，X4為ADM的量（mg）。表2 試驗方案與結果試驗號因素YX1X2X3X4(mg)11(a)2(5.5)4(0.6%)7(15)25.0322(a)4(6)8(1.5%)5(9)20.7433(a)6(7)3(0.4%)3(5)13.7844(b)8(8)7(1.2%)1(3)3.4955(b)1(5)2(0.2%)8(17)24.7366(b)3(5.5)6(1.0%)6(12)20.7277(c)5(6.5)1(0%)4(7)9.9188(c)7(7.5)5(0.8%)2(4)3.1199(c)9(8.5)9(2%)9(25)0.61 將均勻設計各次實驗所得樣品進行包封率（ER）測定，電鏡觀察外觀（AP）及粒徑大小（PD）計算，以PD、AP（滿分值各為10分）和ER（實際計算百分值）為評價指標，按下式進行綜合評分，Y＝AP+PD+ER/10，測定結果見表2。另設a=1，b=2，c=3，在微機上經SAS6.12統(tǒng)計軟件多元逐步回歸分析，得回歸方程：y=60.3352-3.6812x1-6.2518x2+0.1775x4,n=9，s=5.2017，r=0.9219，F=7.82>F0.1(4,3)=5.34。根據回歸分析：x1和x2系數為負，宜取下限值，x4系數為正，表明其取值宜大。x3與Y間相關性差，在逐步回歸分析時被去除，表明在所取值范圍內，對結果影響不大。最后，經綜合考察，制備ADM-PBCA的優(yōu)化條件為：x1=a,x2=5,x3=1.5%,x4=10。并將各取值代入方程得Y=27.17,與實測值27.01相近。另外,參考文獻[3,4]對其他因素進行考察，溫度對實驗結果影響不大，室溫即可。攪拌速度對粒徑影響不很大，攪拌時間為2hr。Tween-80作為表面活性劑可促進制劑的物理穩(wěn)定性。無水Na2SO4是常用的沉淀劑,但Na2SO4的加入可致凝聚過快，微粒成團出現，本系統(tǒng)中水本身可作為成囊過程的引發(fā)劑，故不采用Na2SO4。最后，我們設計了制備工藝如下：取PBCA0.3ml于干燥小燒杯中，另一小燒杯中加入10mgADM，2.5ml6%右旋糖酐，3滴吐溫-80，適量水并用稀鹽酸調節(jié)PH＝5.0，使成均勻液10ml，在磁力攪拌下，將上述溶液用細針頭緩緩注入PBCA中，連續(xù)攪拌2hr，過0.45μm濾膜除去大粒徑粒子，即得。2．1．2阿霉素復合磷脂毫微粒（產品B）的制備 根據”2．1．1項下”的篩選，我們得到了粒徑小，包封率較高的產品A，下一步，我們采用磷脂材料對產品A進行包裹，并對制備方法及影響因素進行了探討。2．1．2．1制備方法的影響 按照常規(guī)的脂質體制備方法[5]，將上述得到的阿霉素毫微粒（產品A）制備成脂質體。方法1（干膜法）：取溶有大豆磷脂180mg與膽固醇100mg的乙醚混合液10ml，置于圓底燒瓶中，在真空水泵上抽干成一均勻脂膜,加入制好的產品A液10ml溶脹30min后，水浴超聲（1min1次，共2次）至成懸濁液，然后將懸濁液再在探頭式超聲處理機上處理（60s一次,共10次，每次間隔10s），并過0.45μm濾膜除去大粒徑粒子后,即得。方法2（逆相蒸發(fā)法）：將大豆磷脂180mg，膽固醇100mg溶于30ml乙醚中，加入上述制好的產品A液10ml，進行短時超聲，直至形成穩(wěn)定的W/O型乳劑。然后減壓蒸發(fā)除去有機溶劑，達到膠態(tài)后，滴加PBS緩沖液（PH＝5.0）5ml，旋轉幫助器壁上的凝膠脫落，然后在減壓下繼續(xù)蒸發(fā)，制得水性混懸液,并過0.45μm濾膜除去大粒徑粒子后即得。比較法1和法2的產品，法1得到的平均粒徑為256.2nm，法2得到平均粒徑為2185.1nm，前者小于后者，且后者穩(wěn)定性比前者差。2．1．2．2膜材的用量 從以上結果來看，我們采用法1（干膜法）制備產品B，對卵磷脂/膽固醇的配比用量，我們試過四種比例（100mg/100mg；180mg/100mg；200mg/200mg；300mg/100mg），從包封率和粒徑方面考慮，以卵磷脂（180mg）/膽固醇（100mg）的配比為最佳。2．1．3阿霉素脂質體的制備（產品C） 方法同“2．1．2．1項下”的方法1，并將A液換成ADM溶液，即得。2．2質量研究2．2．1形態(tài)觀察 三種產品外觀均為磚紅色均勻乳狀液，分別將產品A、B、C，直接或用2％磷鎢酸負染后，電子顯微鏡下觀察形態(tài)，可以看到：A為大小均勻規(guī)則的圓球形,表面平滑完整；B為較為均勻的圓球形或橢圓形小體，小體中較為清晰的分為兩層；C為近圓球形小體，呈單層膜結構。見附圖1。2．2．2粒徑測定 用透射電鏡（100粒計）拍攝照片，用測微尺對100個小體測定，得到：A平均粒徑為：230.7nm,范圍：100.0nm-425.0nm；B平均粒徑為：256.2nm，范圍：195.0nm-395.0nm；C平均粒徑為：285.0nm，范圍：140.0nm-416.0nm。2．2．3含量測定2．2．3．1標準曲線的繪制 以水為溶劑，對ADM的吸收在200-600nm范圍內進行了掃描（附圖2），精密稱定ADM標準品約10mg，置100ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，再分別精密吸取上述溶液2ml，5ml，6ml，7ml，10ml，分別置25ml容量瓶中并稀釋至刻度，制成濃度為8.16ug/ml，20.40μg/ml，24.48μg/ml，28.56μg/ml，40.80μg/ml的濃度系列，在479.0±1nm處測定上述溶液的吸收度A，以A對濃度C作線性曲線，得標準曲線一：A＝0.022165＋0.020639C（r=0.9999）,ADM水溶液在8μg/ml-40μg/ml濃度范圍內線性關系良好。 以DMSO為溶劑，分別對ADM（見附圖3），膽固醇十卵磷脂（見附圖4）以及PBCA（見附圖5）的吸收在200-600nm范圍內進行了掃描。從掃描圖上看，基質膽固醇十卵磷脂和PBCA在紫外光區(qū)的吸收會對ADM吸收產生干擾，故采用波長479.0±1nm處繪制標準曲線：以DMSO為溶劑，配制了濃度為7.60μg/ml，11.40μg/ml，19.00μg/ml，22.80μg/ml，26.60μg/ml，30.40μg/ml，38.00μg/ml的ADM的濃度系列，在479.0±1nm處測定上述溶液的吸收度A，以A對濃度C作線性曲線，得標準曲線二：A＝-0.012625＋0.019893C（r=0.9999）,ADM的DMSO溶液在8μg/ml-40μg/ml范圍內線性關系良好。2．2．3．2回收率和精密度試驗 取15份空白磷脂毫微粒各1ml，分成3組，每組5份，每組分別加入濃度a：19.00μg/ml，b:26.60μg/ml，c:38.00μg/ml的ADM的DMSO溶液5ml，并用DMSO溶解定容為10ml，在479.0±1nm處測吸收度，代入標準曲線二中計算回收率和精密度，結果見表3。

表3ADM標準曲線的方法回收率和精密度編號分組加入量(μg)測出量(μg)回收率(%)平均回收率(%)精密度(%)a1

96.74101.83

2

96.50101.58

395.0094.7999.78100.651.064

95.64100.67

5

94.4499.41

b1

133.59100.44

2

134.91101.44

3133.00134.47101.11100.400.914

131.9599.21

5

132.7599.81

c1

191.91101.01

2

188.4299.17

3190.00190.68100.36100.580.894

192.94101.55

5

191.57100.83

2．2．3．3樣品測定 將產品A（或B或C）1ml，加入DMSO稀釋至100ml，在479.0±1nm處測A值，將其代入標準曲線二中，測得每毫升產品A（或B或C）中的ADM總量，結果見表4。表4各產品每毫升含藥總量（μg） 產品吸收度A每毫升含藥總量（μg）A0.1951043.0B0.183983.0C0.180968.02．2．4包封率測定2．2．4．1柱分離回收率 取空白復合磷脂毫微粒1ml，分別加入濃度為20.40μg/ml，28.56μg/ml和40.80μg/ml的標準ADM水溶液5ml，混勻后，取1ml加于柱頂端，按“2．2．4．3項下”測定全部洗脫液中ADM總量，與已知的上柱ADM量相比，即得平均柱分離回收率為99.70％±0.65，RSD為0.98％。2．2．4．2柱分離曲線 精密吸取產品A（或B或C）1ml，上SephadexG-50柱（Φ1.2×25cm），用PH＝5.0的PBS緩沖液為洗脫液，1ml/min的流速進行洗脫，每1ml收集一管，直至游離ADM全部流出，測洗脫過程收集的每管中的藥物濃度，以每管藥物濃度對管數作圖，繪制流出曲線，如產品B的流出曲線見附圖6。從分離曲線上得出，流出物依次為：11ml空白洗脫液→10mlADM復合磷脂毫微粒溶液→7ml空白洗脫液→32ml游離ADM溶液→空白洗脫液。2．2．4．3包封率測定 根據“2．2．4．2項下”的柱分離曲線，直接收集25ml體積以后的流出液35ml，移至50ml容量瓶中，加水至刻度，以空白流出液作空白，在479.0±1nm處測定A，代入標準曲線一中求出ADM的量即Wf。另精密吸取產品B1ml至100ml容量瓶中，用DMSO溶解并定容，測A值，代入標準曲線二中，計算出每ml產品B所含ADM總量W總代入公式：包封率（EN％）＝（1－Wf/W總）×100％。Wf為游離ADM含量；W總為磷脂毫微粒中ADM被包封量＋Wf。結果，產品B包封率為86.65％±0.97（n=3）。同法測得產品A包封率為70.09％±1.05（n=3），產品C包封率為56.97%±0.69（n=3）。2．2．5穩(wěn)定性實驗采用加速試驗法，由于磷脂的相變溫度為40-50℃，在75%恒濕條件下，于20，30，40℃進行加速試驗，見表5。

表5加速實驗結果制劑產品溫度（℃）時間（d）外觀包封率(%)平均粒徑(nm)A200磚紅色均勻70.09230.730磚紅色均勻66.47239.2300磚紅色均勻70.09230.730磚紅色均勻65.21242.5400磚紅色均勻70.09230.730磚紅色均勻64.97248.3B200磚紅色均勻86.65256.230磚紅色均勻84.44265.9300磚紅色均勻86.65256.230磚紅色均勻82.69269.2400磚紅色均勻86.65256.230磚紅色均勻76.54296.4C200磚紅色均勻56.97285.030磚紅色均勻23.27292.4300磚紅色均勻56.97285.030深磚紅色均勻20.50309.6400磚紅色均勻56.97285.030深磚紅色均勻10.07669.7

可見包封率大小依次為B＞A＞C，且隨著時間增加產品A、B、C的粒徑都有增大的趨勢，包封率都有減小的趨勢。B的穩(wěn)定性遠好于C。3討論均勻設計是我國學者方開泰教授提出的多因素試驗法，以均勻性為出發(fā)點，其試驗點散布均勻，可以通過少量實驗次數獲得可靠結果。本研究以提高包封率，制得粒徑小而均勻的產品為目的，采用均勻設計法設計實驗，結合微機處理數據，優(yōu)化制備條件，科學性強，重現性好。本實驗進行含量測定時，為了保證測定的準確性，必須使藥物能從載體中釋放出來，而且載體材料對吸收無干擾。故我們選用兼能溶解藥物及所有基質的有機溶劑，并要求該溶劑在被測波長處無吸收，在試用過乙酸乙酯、丙酮－甲醇（3：1）、氯仿、四氫呋喃、DMSO等多種有機溶劑后，最終選定DMSO。因為DMSO比其它幾種溶劑溶解性更好，可使混懸液由混濁變透明，且不干擾測定。參考文獻[6]測定包封率時，發(fā)現將產品上柱分離時如直接以水（PH=7）為洗脫液，毫微粒（或脂質體或復合磷脂毫微粒）能較快流出，而未包入的游離ADM卻難以洗脫下來，可能是鹽酸阿霉素在PH＝7的水中，以阿霉素形式存在，被葡聚糖吸附的較牢。后改換用PH=5.0的PBS緩沖液則既保證了游離ADM的分離，又使ADM也較快流出。本實驗中制得的復合磷脂毫微粒乳狀液中可能有未被磷脂包封的毫微粒存在，但兩者的粒徑范圍有大部分為交叉重疊，只通過S