daam1蓬亂蛋白相關(guān)形態(tài)形成活化因子-1tc課件

蓬亂蛋白相關(guān)形態(tài)形成活化因子-1

〔Dishevelledassociatedactivatorofmorphogenesis-1，Daam1〕

對(duì)心臟發(fā)育是必須的

報(bào)告人：唐超2021-3-19背景簡介蓬亂蛋白相關(guān)形態(tài)形成活化因子-1〔Dishevelledassociatedactivatorofmorphogenesis-1，Daam1〕，是形成素〔formin〕蛋白家族成員之一。在人體各類組織中廣泛表達(dá)。并在介導(dǎo)線性肌動(dòng)蛋白的裝配來調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架中起著重要的作用。早期研究說明在非洲爪蟾Daam蛋白主要對(duì)原腸有重要作用(Habasetal.,2001)而果蠅中DAAM突變表現(xiàn)出氣管缺陷(Matuseketal.,2006).這些早期的研究結(jié)果說明，Daam1影響的組織形態(tài)。

但在哺乳動(dòng)物中Daam1的生理功能迄今都了解不多作者研究發(fā)現(xiàn)作者發(fā)現(xiàn)，Daam1在小鼠發(fā)育中的器官內(nèi)高效表達(dá)，包括心臟。研究使用Daam1-缺陷小鼠顯示，Daam1對(duì)于心臟形態(tài)發(fā)育是必不可少的在亞細(xì)胞水平，Daam1對(duì)于絲狀肌動(dòng)蛋〔F-肌動(dòng)蛋白〕組配和肌原組織以及細(xì)胞粘和定位是必須的。材料與方法一、小鼠胚胎心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞培養(yǎng)二、RT-PCR和原位雜交三、免疫印跡—westernblot四、免疫熒光五、細(xì)胞傷口愈合試驗(yàn)分析六、超聲心電圖分析七、RhoA,Rac1andCdc42結(jié)構(gòu)域活性分析通過GSTpulldown技術(shù)八、用基因誘捕構(gòu)建的Daam1基因缺陷的小鼠模型1、胚胎干細(xì)胞系(cellNo.:RRT390)2、帶各種篩選、報(bào)告基因的誘捕載體基因誘捕(genetrap)是基于小鼠胚胎干細(xì)胞、報(bào)道載體(誘捕載體)建立的一種基因突變方法。誘捕載體在整合位點(diǎn)利用內(nèi)源基因調(diào)控元件模仿內(nèi)源基因表達(dá),使其表達(dá)終止。LTR報(bào)告基因，由上游啟動(dòng)子起始表達(dá)；SA,剪接受體;GFNR,綠熒光硝基復(fù)原酶基因;pPKG,PKG啟動(dòng)子;neo,新霉素抗性基因?；蛘T捕載體系統(tǒng)(ROSA-GFNR)結(jié)構(gòu)示意圖本文作者首先得到一個(gè)在Daam1處插入了突變型小鼠胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞株(cellNo.:RRT390)，可以接受報(bào)告載體的整合。構(gòu)建了一個(gè)lacZ及新霉素篩選位點(diǎn)，融合進(jìn)入ES，導(dǎo)入C57BL/6J品系小鼠內(nèi)繁殖的第一代即為基因缺陷型小鼠。結(jié)果圖A-a：基因誘捕載體示意圖圖A-b：蛋白印跡和DNA電泳圖16.5d胚胎，Het為Daam1等位基因，Mut為純合突變圖B:DNA電泳和蛋白印跡圖。16.5d胚胎各器官，Het為Daam1等位基因，Mut為純合突變1、說明Daam1基因缺陷的小鼠模型構(gòu)建成功2、Daam1在小鼠各處器官均有表達(dá)Daam1在正常小鼠中的表達(dá)譜A--a-c：小鼠胚胎原位雜交檢測Daam1的表達(dá)d-e：10.5d切片分析AVC，房室墊;EC，心內(nèi)膜;EPC，心外膜;圖B：8.5-10.5dDaam1在心臟和腦中PCR檢測Daam1突變小鼠中用半乳糖苷酶染色切片分析發(fā)現(xiàn)Daam1在小鼠全身表達(dá)，在心臟處高表達(dá)10.5d表達(dá)強(qiáng)烈發(fā)育的心臟和

神經(jīng)管用免疫熒光染色E12.5胚胎冰凍切片。WGA：麥胚凝集素特異性染心肌細(xì)胞膜DAPI：特異性然細(xì)胞質(zhì)Daam1gt/gt小鼠的心臟表型和功能特性。切片分析E14.5d、f：DORV畸形h、IVSD畸形切片分析P0d、f、h：DORV畸形j：VSD畸形2月齡Daam1小鼠的病理分析圖C：Daam1突變小鼠左心室壁出現(xiàn)腦回溝疏松結(jié)構(gòu)〔箭頭所示〕圖D-a：心臟與身體的比重。圖D-b：超聲波心電圖分析。說明Daam1突變型小鼠LV心肌變厚。Daam1gt/gt拯救小鼠通過NKx2.5Cre小鼠與Daam1gt/gt小鼠雜交獲得Daam1拯救型小鼠。圖A：基因示意圖圖B:E10.5半乳糖苷酶染色說明拯救成功E14.5胚胎組織切片

Daam1gt/gt/Nkx2-5Cre/+胚胎〔B，D，F(xiàn)〕表現(xiàn)出正常的心臟結(jié)構(gòu)1周齡小鼠組織切片。

daam1gt/+〔A，D〕和Daam1gt/gt/Nkx2-5Cre/+〔C，F(xiàn)〕小鼠表現(xiàn)出正常的室壁和小梁。Daam1gt/gt突變小鼠〔B，E〕顯示

心室致密。作者發(fā)現(xiàn)Daam1缺陷病不影響心肌細(xì)胞分化，增殖或凋亡通過Nkx2-5,Tbx20andGata4心臟早期發(fā)育基因,形態(tài)發(fā)生蛋白BMP10心室標(biāo)志性基因MLC2A、MLC2V都無顯著差異表達(dá)圖A：只有Daam1gt/gt小鼠饑餓后F-肌動(dòng)蛋白明顯降低表達(dá)圖B：E12.5心臟中肌動(dòng)蛋白熒光分析說明，只有Daam1gt/gt小鼠肌動(dòng)蛋白表達(dá)量很低以上結(jié)果說明：在心肌細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的形成和橫紋肌組織的形成是需要Daam1的Daam1gt/gt小鼠在心肌細(xì)胞中橫紋肌的形成受到干擾圖A:E12.5Daam1gt/gt小鼠心肌細(xì)胞的粘附蛋白α-catenin和N-cadherin表達(dá)明顯混亂圖B：Daam1gt/gt小鼠橋粒連接異常圖C:E12.5Daam1gt/gt小鼠心肌黏接細(xì)胞排列無規(guī)那么圖D：Daam1gt/gt小鼠連接細(xì)胞變少圖d：為差異