微生物鑒定中常用的生理生化實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)九

微生物鑒定中常用的生理生化實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.證明不同微生物對(duì)各種有機(jī)大分子物質(zhì)的水解能力不同，從而說明不同微生物有著不同的酶系統(tǒng)。2.掌握進(jìn)行微生物大分子物質(zhì)水解實(shí)驗(yàn)的原理和方法。3.了解IMViC與硫化氫反應(yīng)的原理及其在腸道細(xì)菌鑒定中的意義和方法。二、實(shí)驗(yàn)材料1.菌種枯草芽孢桿菌，大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌，普通變形桿菌，產(chǎn)氣腸桿菌。2.培養(yǎng)基固體淀粉培養(yǎng)基，明膠培養(yǎng)基試管，尿素瓊脂試管，醋酸鉛培養(yǎng)基，葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基。3.溶液和試劑革蘭氏染色用盧戈氏碘液，甲基紅指示劑。三、實(shí)驗(yàn)原理1.蛋白質(zhì)水解試驗(yàn)：微生物

對(duì)大分子物質(zhì)如淀粉不能直接利用，必須依靠產(chǎn)生的胞外酶將大分子物質(zhì)分解后，才能被微生物吸收利用。胞外酶主要為水解酶，裂解大分子為較小化合物，使其能被運(yùn)輸至細(xì)胞內(nèi)。如淀粉酶水解淀粉為小分子的糊精、雙糖和單糖，這過程可通過觀察細(xì)菌菌落周圍的物質(zhì)變化來證實(shí)。淀粉遇碘液會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色，在細(xì)菌水解淀粉的區(qū)域，用碘液測(cè)定時(shí)不再產(chǎn)生藍(lán)色，表明細(xì)菌產(chǎn)生淀粉酶。2.明膠液化試驗(yàn)：明膠是由膠原蛋白水解產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，在25℃以下可維持凝膠狀態(tài)，以固體形式存在，而在25℃以上明膠會(huì)液化。有些微生物可產(chǎn)生一種稱作明膠酶的胞外酶，水解這種蛋白質(zhì)，而使明膠液化，甚至在4℃仍能保持液化狀態(tài)。尿素是由大多數(shù)哺乳動(dòng)物消化蛋白質(zhì)分泌在尿液中的廢物，尿素酶能分解尿素釋放出氨，這是一個(gè)分辨細(xì)菌很有用的診斷試驗(yàn)。盡管許多微生物都可以產(chǎn)生尿素酶，但它們利用尿素的速度比變形桿菌屬的細(xì)菌要慢，因此，尿素酶試驗(yàn)被用來從其他非發(fā)酵乳糖的腸道微生物中快速區(qū)分這個(gè)屬的成員。尿素瓊脂含有尿素葡萄糖和酚紅，酚紅在pH6.8時(shí)為黃色，而在培養(yǎng)過程中，產(chǎn)生尿素酶的細(xì)菌將分解尿素產(chǎn)生氨，使培養(yǎng)基的pH升高，在pH升至8.4時(shí)，指示劑就轉(zhuǎn)變?yōu)樯罘奂t色。3.尿素試驗(yàn)：4.硫化氫試驗(yàn)：硫化氫試驗(yàn)是檢測(cè)硫化氫的產(chǎn)生，也是用于腸道細(xì)菌檢查常用生化試驗(yàn)。有些細(xì)菌能分解含硫的有機(jī)物如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等產(chǎn)生硫化氫，硫化氫一遇培養(yǎng)基中鉛鹽或鐵鹽等，就形成黑色的硫化鉛或硫化亞鐵沉淀物。5.甲基紅試驗(yàn)：甲基紅試驗(yàn)是用來檢測(cè)葡萄糖產(chǎn)生的有機(jī)酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。當(dāng)細(xì)菌代謝糖產(chǎn)生酸時(shí)，培養(yǎng)基就會(huì)變酸，使加入培養(yǎng)基中的甲基紅指示劑由橙黃色（pH6.3）轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色（pH4.2），即甲基紅反應(yīng)。盡管所有的腸道微生物都能發(fā)酵葡糖產(chǎn)生有機(jī)酸，但這個(gè)試驗(yàn)在區(qū)分大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌上仍然是有價(jià)值的。這兩個(gè)細(xì)菌在培養(yǎng)的早期均產(chǎn)生有機(jī)酸，但大腸桿菌在培養(yǎng)后期仍能維持酸性pH4，而產(chǎn)氣腸桿菌則轉(zhuǎn)化有機(jī)酸為非酸性末端產(chǎn)物，如乙醇、丙酮酸等，使pH升至大約6。因此大腸桿菌為陽性，產(chǎn)氣腸桿菌為陰性。6.檸檬酸鹽試驗(yàn)：檸檬酸鹽試驗(yàn)是用來檢測(cè)檸檬酸是否被利用。有些細(xì)菌利用檸檬酸鹽作為碳源；而另一些細(xì)菌不能利用檸檬酸鹽，如產(chǎn)氣腸桿菌。細(xì)菌在分解檸檬酸鹽及培養(yǎng)基中的磷酸銨后，產(chǎn)生堿性化合物，使培養(yǎng)基的pH升高，當(dāng)加入1%溴麝香草酚藍(lán)指示劑時(shí)，培養(yǎng)基就會(huì)由綠色轉(zhuǎn)變?yōu)樯钏{(lán)色。溴麝香草酚藍(lán)指示范圍為：pH小于6.0時(shí)呈黃色，pH在6.5~7.0時(shí)為綠色，pH大于7.6時(shí)呈藍(lán)色。三、實(shí)驗(yàn)步驟（一）、淀粉水解實(shí)驗(yàn)1.將固體淀粉培養(yǎng)基熔化后冷卻至50°C左右，無菌操作制成平板。2.用記號(hào)筆在平板底部劃成4部分。3.將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌分別在不同的部分劃線接種，在平板的反面分別在4部分寫上菌名。4.將平板倒置在37°C溫箱中