熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)污水中硝化細(xì)菌的條件優(yōu)化

熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)污水中硝化細(xì)菌的條件優(yōu)化

硝化細(xì)菌是一種具有優(yōu)良耐腐蝕性的革蘭氏陰性菌，包括亞硝化細(xì)菌和硝酸菌。這對(duì)促進(jìn)氮素的整個(gè)循環(huán)和從廢水中清除氮具有非常重要的意義。因此，我們不僅可以監(jiān)測(cè)水質(zhì)的變化，還可以監(jiān)測(cè)環(huán)境中數(shù)量的變化對(duì)氨氮的去除效率起到指導(dǎo)作用。檢測(cè)硝化細(xì)菌的傳統(tǒng)方法不但費(fèi)時(shí)費(fèi)力,且細(xì)菌計(jì)數(shù)困難、不準(zhǔn)確.隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,分子生物學(xué)方法已經(jīng)成為現(xiàn)代環(huán)境微生物學(xué)的重要手段.熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)技術(shù)的原理是dsDNA變性后和帶有互補(bǔ)序列的同源單鏈退火配對(duì)形成雙鏈結(jié)構(gòu)的過程.退火復(fù)性形成的可以是雙鏈DNA或DNA/RNA異質(zhì)雙鏈分子,帶有熒光標(biāo)記的探針與固定在玻片或纖維膜上組織或細(xì)胞中特定的核苷酸序列進(jìn)行雜交,探測(cè)其中所有的同源核酸序列,結(jié)果直接在熒光顯微鏡下即可觀察,無需單獨(dú)分離DNA或RNA.該技術(shù)特異性和靈敏度極高,具有傳統(tǒng)方法不可比擬的優(yōu)勢(shì),使研究環(huán)境中那些數(shù)量少,培養(yǎng)難度大的微生物問題得以解決,并可提供環(huán)境微生物數(shù)量和空間分布等多種信息.國外應(yīng)用FISH技術(shù)研究活性污泥或生物膜中硝化細(xì)菌分布的研究較多,通常根據(jù)樣本中熒光面積相對(duì)大小表示細(xì)菌存在情況,由于對(duì)環(huán)境樣本沒有進(jìn)一步處理,使定量結(jié)果有一定的局限性.本文重點(diǎn)探討環(huán)境樣本硝化細(xì)菌定量監(jiān)測(cè)中FISH技術(shù)的應(yīng)用,并篩選出FISH技術(shù)用于環(huán)境硝化細(xì)菌檢測(cè)的最佳條件,從而使環(huán)境硝化細(xì)菌定量監(jiān)測(cè)更快、更準(zhǔn)確、更簡(jiǎn)便.1材料和方法1.1fish法測(cè)定了硝化細(xì)菌的步驟1.1.1玻璃處理11玻璃清潔熱肥皂水刷洗,1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鹽酸浸泡24h,再在0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))焦碳酸二乙酯(DEPC)中浸泡24h.2硅化處理玻片和蓋玻片1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鹽酸煮沸10min,烘干,錫紙包好4℃保存?zhèn)溆?31明膠膏將烘干的玻片放入明膠中10min,然后60℃烘干過夜備用.1.1.2樣品采集和預(yù)處理1樣品的制備和固化用0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))DEPC浸泡的聚乙烯管子采樣;4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的多聚甲醛于4℃固定4h;將固定樣本用磷酸緩沖液離心漂洗2次,用w(PBS)∶w(乙醇)=1∶1液稀釋備用;10μL的樣品涂于包埋明膠的玻片,37℃的烘箱熱固定;依次用50%,80%,96%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))乙醇室溫下脫水.2水質(zhì)水樣直接按1∶1加入4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的多聚甲醛,4℃固定4h,用蘇丹黑B染色,硝酸纖維膜過濾后,進(jìn)行熱固定、脫水等處理步驟.1.1.3sse-lssds和1.2.7.7.3.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7重組病毒雜交.6.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7亞硝化細(xì)菌探針和硝酸菌探針見表1.密閉雜交盒里放吸水紙,雜交液濕潤.載玻片上加入24μL的雜交液和1μL探針,加蓋玻片,雜交盒內(nèi)進(jìn)行雜交反應(yīng).雜交溫度與雜交時(shí)間經(jīng)正交試驗(yàn)確定.探針質(zhì)量濃度均為50ng/μL.雜交液配制:SDS0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),Tris-HCl(pH8.0)20mmol/L,NaCl900mmol/L,硝酸菌雜交液含去離子甲酰胺(DAF)40%(質(zhì)量分?jǐn)?shù));亞硝化細(xì)菌雜交液含去離子甲酰胺(DAF)55%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)).1.1.4洗脫探針的配制雜交盒中取出載玻片放入48℃雜交洗脫液20min后,ddH2O漂洗,晾干.洗脫液配制:Tris-HCl(pH8.0)20mmol/L,SDS0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),洗脫探針NIT3時(shí)EDTA56mmol/L,洗脫探針NSO190時(shí)EDTA20mmol/L,NaCl濃度經(jīng)正交試驗(yàn)確定.1.1.5硝化細(xì)菌數(shù)目玻片在熒光顯微鏡(NIKON-26188)下觀察,濾光片為B光源.陽性為橙色、綠色,觀測(cè)30個(gè)視野記錄硝化細(xì)菌數(shù)目.細(xì)菌豐度(cells/g或cells/L)為AS1/(S2V),其中,A為視野中細(xì)菌平均數(shù);S1為樣品涂抹的面積;S2為視野面積;V為樣品體積.1.1.6比較陰性對(duì)照:樣品進(jìn)行雜交,雜交液中不含探針.陽性對(duì)照:標(biāo)準(zhǔn)亞硝化細(xì)菌和硝酸菌.1.2硝化細(xì)胞檢測(cè)條件的優(yōu)化設(shè)計(jì)1.2.1a因素設(shè)計(jì)水平選用L9(34)正交表做試驗(yàn).優(yōu)化因素:Aa為熱固定時(shí)間因素;Ba為乙醇脫水時(shí)間因素.Aa因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平:Aa1a1=1h,Aa2a2=2h,Aa3a3=3h;Ba因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平:Ba1a1=3min,Ba2a2=5min,Ba3=7min.雜交條件依照亞硝化細(xì)菌正交優(yōu)化的條件進(jìn)行,同時(shí)考慮Aa,Ba間的交互作用,相同實(shí)驗(yàn)條件下重復(fù)3次.1.2.2ssr-cb法選用L9(34)正交表做試驗(yàn),硝酸菌NIT3探針優(yōu)化因素:Ab為雜交溫度因素;Bb為雜交時(shí)間因素;Cb為洗脫液中NaCl濃度因素.Ab因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平:Ab1=46℃,Ab2=37℃,Ab3=55℃;Bb因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平:Bb1=3h,Bb2=1h,Bb3=5h;Cb因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平:Cb1=60mmol/L,Cb2=300mmol/L,Cb3=540mmol/L.不考慮Ab,Bb,Cb間的交互作用,相同實(shí)驗(yàn)條件下重復(fù)3次.亞硝化細(xì)菌NSO190探針優(yōu)化因素:Ac為雜交溫度因素;Bc為雜交時(shí)間因素;Cc為洗脫液中NaCl濃度因素.Ac因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平:Ac1=46℃,Ac2=37℃,Ac3=55℃;Bc因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平:Bc1=3h,Bc2=1h,Bc3=5h;Cc因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平:Cc1=20mmol/L,Cc2=60mmol/L,Cc3=100mmol/L.不考慮Ac,Bc,Cc間的交互作用,相同實(shí)驗(yàn)條件下重復(fù)3次.1.3細(xì)菌培養(yǎng)和檢測(cè)初步確定亞硝化細(xì)菌與硝酸菌檢測(cè)條件的基礎(chǔ)后,對(duì)太湖的梅梁灣、玄武湖凌州水樣以及南京鎖金村污水處理廠的活性污泥進(jìn)行樣本中硝化細(xì)菌的檢測(cè)與比較.相同實(shí)驗(yàn)條件下每份樣品重復(fù)5次.2結(jié)果與討論2.1結(jié)果2.1.1影響因素的選取從表2看到,RAa,RBa,RAa*Ba分別為0.115,0.062,0.045,從極差值大小來看,主要影響因素是Aa因素,其次為Ba因素;Aa*Ba交互作用極差值大于0,說明二者存在交互作用.考慮到Aa,Ba因素之間存在交互作用,再做析因分析,得到熱固定2h,乙醇脫水3min為最佳水平搭配.因此,最佳的樣品預(yù)處理?xiàng)l件為:熱固定2h,乙醇脫水3min.2.1.2極差值分析從表3看到,RAc,RBc,RCc分別為0.399,0.111,0.098,從極差值大小可知,對(duì)結(jié)果影響大小依次為Ac,Bc,Cc.根據(jù)極差值分析得到亞硝化細(xì)菌雜交反應(yīng)較好水平搭配為:雜交溫度46℃,雜交時(shí)間3h,NaCl濃度20mmol/L.2.1.3種雜交試驗(yàn)結(jié)果從表4看到,RAb,RCb,RBb分別為25.25,25.19,7.2,從極差值看Ab,Bb因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響大于Cb因素.極差值分析認(rèn)為較好水平搭配為:雜交溫度46℃,雜交時(shí)間5h,NaCl濃度60mmol/L.由于正交試驗(yàn)中沒有涉及到這種水平搭配,而從正交試驗(yàn)結(jié)果看雜交溫度46℃,雜交時(shí)間3h,NaCl濃度60mmol/L為較好水平搭配.因此,再對(duì)這2種組合同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步對(duì)優(yōu)化條件驗(yàn)證.結(jié)果經(jīng)t檢驗(yàn),按α=0.05水平,這2種水平搭配對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05).2種條件下測(cè)得的硝酸菌平均值分別為(1.13±0.16)×107和(0.96±0.07)×107cells/g.由此,硝酸菌的最優(yōu)雜交條件為:雜交溫度46℃,雜交時(shí)間5h,NaCl濃度60mmol/L.2.1.4群落微生物環(huán)境應(yīng)用本研究確定的優(yōu)化條件,對(duì)太湖、玄武湖水及南京鎖金村污水處理廠活性污泥中硝化細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果見表5.由表5可以看出,太湖、玄武湖水中的亞硝化細(xì)菌數(shù)量比硝酸菌低一個(gè)數(shù)量級(jí),這是否反映該類水體的微生物含量不利于氮的轉(zhuǎn)化,還需要研究玄武湖的硝化細(xì)菌數(shù)量與富營養(yǎng)化水體關(guān)系,以及硝化細(xì)菌數(shù)量與NH+4-N,NO-3-N含量和相關(guān)環(huán)境因素的關(guān)系.活性污泥中亞硝化細(xì)菌數(shù)量較低,微生物環(huán)境不利于氮的去除.2.2硝酸鹽發(fā)酵組合研究結(jié)果顯示,樣品處理中,熱固定因素對(duì)結(jié)果有明顯影響,當(dāng)固定的時(shí)間為2h時(shí),樣品與明膠的粘附效果最佳,最有利于檢測(cè),并且熱固定與乙醇脫水時(shí)間存在交互作用.因此,樣品預(yù)處理較優(yōu)的條件為熱固定2h,乙醇脫水3min.在FISH試驗(yàn)中雜交溫度、雜交時(shí)間和洗脫液中NaCl濃度對(duì)結(jié)果都有一定影響.雜交時(shí)間與雜交溫度均影響探針的特異性,在一定溫度范圍內(nèi)提高雜交溫度可以提高探針特異性;雜交時(shí)間過短會(huì)造成探針結(jié)合不完全,雜交時(shí)間過長會(huì)增加非特異性著色;雜交洗脫液NaCl濃度過高可降低探針的特異性.本研究顯示,硝酸菌較好的雜交條件組合為雜交溫度46℃,雜交時(shí)間5h,NaCl濃度60mmol/L;亞硝化細(xì)菌較好的雜交條件組合為雜交溫度46℃,雜交時(shí)間3h,NaCl濃度20mmol/L.亞硝化細(xì)菌和硝酸菌數(shù)量是水體中氮循環(huán)進(jìn)程的重要指標(biāo),與NH+4-N和NO-3-N含量之間存在相關(guān)關(guān)系.水體中氮循環(huán)的改變會(huì)導(dǎo)致水體化學(xué)特征的改變,進(jìn)而使硝化細(xì)菌群落在種類和數(shù)量上隨之發(fā)生改變.硝化細(xì)菌的這種改變直接反映了所處水體的氮循環(huán)狀態(tài),對(duì)反映水體富營養(yǎng)化程度具有重要意義.目前西湖、玄武湖、東湖處于中富營養(yǎng)化狀態(tài),太湖處于輕富營養(yǎng)化狀態(tài).從已報(bào)道資料看,西湖、太湖、東湖水中亞硝化細(xì)菌數(shù)量基本上比硝酸菌低一個(gè)數(shù)量級(jí).有關(guān)杭州西湖的資料報(bào)道,水體中硝酸菌和亞硝化細(xì)菌數(shù)量分別為3.2×103cells/mL和5.85×103cells/mL.本研究中應(yīng)用FISH技術(shù)測(cè)得玄武湖與太湖的硝酸菌(103cells/mL)和亞硝化細(xì)菌數(shù)量(103cells/mL)相當(dāng),二者的亞硝化細(xì)菌數(shù)量比硝酸菌也低一個(gè)數(shù)量級(jí).可見,亞硝化細(xì)菌含量普遍低于硝酸菌含量是富營養(yǎng)化水體的一個(gè)共同特征.有研究認(rèn)為,在濕地以及除氮效率比較高的水生高等植物群落內(nèi)的亞硝化細(xì)菌數(shù)量比硝酸菌高2～3個(gè)數(shù)量級(jí),這表明濕地的環(huán)境條件更適于亞硝化細(xì)菌大量生長,從而提高氮的去除.南京鎖金村污水處理廠活性污泥中亞硝化細(xì)菌、硝酸菌含量較低與該污水處理廠沒有脫氮工藝,缺乏硝化細(xì)菌大量繁殖的環(huán)境條件有關(guān).但是環(huán)境條件與硝化細(xì)菌分布、數(shù)量和脫氮相互之間的關(guān)系還需進(jìn)一步研究.利用FISH技術(shù)研究水體中的硝化細(xì)菌數(shù)量與NH+4-N和NO-3-N相關(guān)性,可以準(zhǔn)確快速地對(duì)水體中硝化細(xì)菌的數(shù)量進(jìn)行監(jiān)測(cè),評(píng)價(jià)水體的氮循環(huán)狀態(tài),