增生性瘢痕模型的建立

增生性瘢痕模型的建立

多年來(lái)，國(guó)內(nèi)外科學(xué)家一直在研究疤痕動(dòng)物模型。Morris證實(shí)在兔耳急性及慢性創(chuàng)面上有明顯的真皮過(guò)度增生。我們?cè)谟猛枚M(jìn)行缺血性創(chuàng)面愈合的研究中,也注意到有真皮過(guò)度增生的現(xiàn)象。從1998年起,我們開始在兔耳進(jìn)行建立增生性瘢痕模型研究的基礎(chǔ)上,作了進(jìn)一步的探索。1材料和方法1.1耳緣密度的測(cè)定選用日本大耳白兔共47只(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),雌雄不拘,體重1.5~2.0kg。用3%戊巴比妥鈉(1.5mgkg)耳緣靜脈麻醉,然后分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(1)選用41只兔雙耳腹側(cè)面作6mm直徑全層皮膚缺損創(chuàng)面340個(gè),每耳4~6處。并作同時(shí)切除耳軟骨的創(chuàng)面12個(gè)分布在圓形創(chuàng)面間。其中還有2只兔在耳腹面圓形創(chuàng)面非對(duì)應(yīng)的耳背同時(shí)制作圓形創(chuàng)面,每耳6個(gè),共24處。(2)選6只兔雙耳腹面作1.5cm×4.5cm長(zhǎng)方形全層皮缺損創(chuàng)面,每耳1個(gè),共12處。1.2觀察指標(biāo)和方法2結(jié)果2.1海洋創(chuàng)生塊的生長(zhǎng)兔耳腹側(cè)圓形創(chuàng)面上皮化后,局部逐漸隆起,呈淡紅色,上皮化后20~25d增生塊厚度為耳腹側(cè)面全層皮厚度的3~4倍(圖1),增生塊發(fā)生率為70%,到創(chuàng)面愈合后60d部分增生塊開始變軟,一半以上的增生塊維持原狀,本組增生塊最長(zhǎng)持續(xù)時(shí)間為150d。長(zhǎng)方形創(chuàng)面上皮化時(shí)間平均50d,增生塊出現(xiàn)率在80%以上,持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)已超過(guò)262d。去軟骨組增生塊發(fā)生情況無(wú)明顯差異。對(duì)圓形增生塊測(cè)量結(jié)果如表1。經(jīng)方差分析,各時(shí)間點(diǎn)之間差異有非常顯著性意義(P<0.01)。TGF-β組、IFN-γ組分別與非注藥組間差異有非常顯著性意義(P<0.01)。2.2皮質(zhì)結(jié)構(gòu)圖12兔耳增生塊以真皮組織增生為主,鏡下早期見(jiàn)大量聚集的成纖維細(xì)胞,后期則以膠原為主。真皮深層呈水平向排列,而淺層則呈結(jié)節(jié)或漩渦狀分布(圖2)。在上皮化后,創(chuàng)基注入TGF-β1組其增生塊高度明顯大于生理鹽水組,IFN-γ組則明顯低于TFG-β1組(圖3)。2.3d與d之間的相關(guān)性正常兔耳皮膚Ⅲ型膠原占22.174%,長(zhǎng)方形創(chuàng)面90d增生塊中為42.635%,而150d為37.108%。經(jīng)方差檢驗(yàn)P<0.01,三者間差異有非常顯著性意義。用地高辛標(biāo)記的Ⅰ、Ⅲ型前膠原cDNA探針進(jìn)行組織切片原位雜交,發(fā)現(xiàn)兔耳正常皮膚Ⅰ、Ⅲ前膠原的mRNA為陰性,圓形創(chuàng)面上皮化后各時(shí)間點(diǎn)Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達(dá)均呈陽(yáng)性,并持續(xù)到傷口上皮化后50d。2.4tgf-fmrna表達(dá)動(dòng)力學(xué)用TGF-β寡核苷酸探針進(jìn)行原位雜交,結(jié)果對(duì)照組為陰性,實(shí)驗(yàn)各組的成纖維細(xì)胞中TGF-β1mRNA均為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),加用外源性TGF-β1組表達(dá)最為明顯,隨著時(shí)間推移,表達(dá)信號(hào)減弱,但至上皮化后70d仍為陽(yáng)性表達(dá)。2.5tgf-1組不同壓藥后細(xì)胞凋亡情況傷后7dTUNEL染色肉芽組織中未見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞,14d肉芽組織中有少量陽(yáng)性細(xì)胞,31d(已上皮化)凋亡細(xì)胞增加,60~80d,真皮中有較多凋亡的成纖維細(xì)胞(60個(gè)高倍鏡視野),至100d未見(jiàn)凋亡細(xì)胞,此時(shí)瘢痕的高度已明顯下降。用TGF-β1組,傷后40~60d(注藥后10~30d)凋亡的成纖維細(xì)胞很少,100d未見(jiàn)凋亡細(xì)胞。IFN-γ組注藥次日(第31d)即可查明真皮內(nèi)有廣泛的成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡(約100個(gè)高倍鏡視野,圖4),60d(注藥后30d)增生塊平坦,偶見(jiàn)有凋亡的成纖維細(xì)胞。成纖維細(xì)胞凋亡出現(xiàn)時(shí)間(d)與數(shù)量的關(guān)系見(jiàn)圖5。3家兔耳分生片外源性tgf-1、ifn1的表達(dá)“由于不明原因,瘢痕疙瘩(K)和增生性瘢痕(HS)只發(fā)生于人類,企圖建立病理性瘢痕動(dòng)物模型一直未能成功”。1951年就曾有K、HS在動(dòng)物身上發(fā)生的報(bào)道,但均無(wú)法重復(fù)驗(yàn)證,因此至今沒(méi)有由動(dòng)物自身產(chǎn)生的病理瘢痕模型。我們于1997年在兔耳進(jìn)行缺血性創(chuàng)面愈合的研究中,觀察到有真皮過(guò)度增生現(xiàn)象。與Morris在兔耳急性與慢性創(chuàng)面有明顯的真皮過(guò)度增生現(xiàn)象一致。1998年我們開始在兔耳進(jìn)行建立增生性瘢痕動(dòng)物模型的探索,在此基礎(chǔ)上先后選用47只日本大耳白兔的雙耳,制作圓形、長(zhǎng)方形等創(chuàng)面共388個(gè),發(fā)現(xiàn)兔耳腹面圓形創(chuàng)面有70%發(fā)生增生塊、長(zhǎng)方形創(chuàng)面增生塊發(fā)生長(zhǎng)率更高,大于80%,增生塊厚度為兔耳腹面皮膚的3~4倍,增生塊持續(xù)時(shí)間圓形塊最長(zhǎng)為150d,長(zhǎng)方形塊最長(zhǎng)已超過(guò)262d。組織學(xué)證明,兔耳創(chuàng)面增生塊主要是真皮中有大量成纖維細(xì)胞增殖,并有少量膠原沉積,隨著時(shí)間推移,膠原成份增多真皮淺層結(jié)構(gòu)呈結(jié)節(jié)狀或漩渦狀排列,與人HS結(jié)構(gòu)相似。用地高辛標(biāo)記的Ⅰ、Ⅲ前膠原cDNA探針行原位雜交,進(jìn)一步檢測(cè)增生塊中Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA的表達(dá),發(fā)現(xiàn)兔耳正常皮膚中Ⅰ、Ⅲ型前膠原的mRNA表達(dá)為陰性,而兔耳創(chuàng)面增生塊中兩者均呈陽(yáng)性表達(dá),且持續(xù)到上皮化后50d。結(jié)果也表明,兔耳增生塊中膠原過(guò)度沉積特別是Ⅲ型膠原比例增加,是在基因水平進(jìn)行調(diào)控的。其機(jī)理雖不很清楚,但人類HS中TGF-β1與此有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)加入外源性TGF-β1組,其Ⅰ、Ⅲ前膠原表達(dá)最強(qiáng)。為此,我們對(duì)兔耳增生塊中TGF-β1的作用進(jìn)行了分析。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中對(duì)兔耳創(chuàng)面注入TGF-β1及INF-γ,結(jié)果TGF-β1組的增生塊明顯高于對(duì)照組,而IFN-γ組則表現(xiàn)為抑制其增生,提示兔耳增生塊對(duì)二者的反應(yīng)與人類HS相似。以上檢測(cè)從組織學(xué),增生塊中Ⅰ、Ⅲ型膠原的構(gòu)成,TGF-β1對(duì)增生塊的影響等,都證實(shí)兔耳增生塊與人類HS發(fā)生過(guò)程及其結(jié)構(gòu)都很相似。我們對(duì)兔耳增生塊進(jìn)行了細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)觀察。Clark指出,在皮膚傷口修復(fù)中,一旦上皮化后,成纖維細(xì)胞就進(jìn)入凋亡途徑。依此推論,兔耳圓形創(chuàng)面在上皮化(平均20d)后,就應(yīng)出現(xiàn)凋亡高峰,而我們看到其高峰推遲到60d才出現(xiàn),此前正是增生塊增生最明顯的時(shí)期。當(dāng)加用外源性TGF-β1后,一方面表現(xiàn)為增生塊增生更明顯,同時(shí)成纖維細(xì)胞凋亡峰值更向后推遲,直至第80d才出現(xiàn)。而使用IFN-γ后的次日,就可以見(jiàn)到大量凋亡細(xì)胞。事實(shí)表明,利用此模型不僅可以連續(xù)地觀察瘢痕增生過(guò)程中細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)變化,這是其它研究方法無(wú)法辦到的,而且證實(shí)兔耳增生塊的發(fā)生、發(fā)展與人類HS有很大的相似性。我們還用此模型對(duì)成纖維細(xì)胞與肌成纖維細(xì)胞在傷口收縮與瘢痕收縮中的作用進(jìn)行了研究(另文報(bào)道)和有關(guān)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)與瘢痕增生關(guān)系等研究。故可認(rèn)為,兔耳創(chuàng)面可以產(chǎn)生類似人類增生性瘢痕樣的病理改變,可以利用此模型進(jìn)行有關(guān)瘢痕的各項(xiàng)研究。(本文圖1~4見(jiàn)插圖5-1)1.2.1大體觀察在圓形創(chuàng)面形成后的30,40,5060,80,100d,分別切取增生塊及周圍正常組織,每時(shí)點(diǎn)取3只兔的標(biāo)本進(jìn)行HE染色,并在低倍鏡下用微尺按以下公式測(cè)算出增生塊相對(duì)增生的厚度:1.2.2組織學(xué)及免疫組化觀察兔耳增生塊分別用HE、VG、Masson染色,檢查膠原纖維及成纖維細(xì)胞;愛(ài)仙藍(lán)(AB)染色檢查糖胺多糖。1.2.3觀察外源性TGF-β1、IFN-γ對(duì)兔耳增生塊的影響。在實(shí)驗(yàn)(1)組中,選18只白兔耳腹面圓形創(chuàng)面,在第30d,分別注入IFN-γ0.025ml(4000萬(wàn)UL);TGF-β10.025ml(0.2gL);生理鹽水0.025ml(對(duì)照組)。每組36個(gè)圓形創(chuàng)面。觀察項(xiàng)目同前。測(cè)。上皮化(平均為50d))后分別于傷后90,150d,各取4個(gè)增生塊及周圍組織進(jìn)行SDS-聚丙烯凝膠電泳分析,檢測(cè)其Ⅰ、Ⅲ型膠原的比率。1.2.5對(duì)上皮化后0,10,20,30,50及70d的圓形增生塊,用地高辛標(biāo)記的Ⅰ、Ⅲ型前膠原cDNA探針行原位雜交,檢測(cè)增生塊中Ⅰ、Ⅲ型前膠原。110,20,30,50及70d兔耳增生塊中的TGF-β1mRNA進(jìn)行檢測(cè)。1.2.7利用兔耳模型進(jìn)行細(xì)胞凋亡的觀察。用12只兔雙耳腹面圓形創(chuàng)面,于第30