三聚氰胺急性毒性和蓄積性試驗

三聚氰胺急性毒性和蓄積性試驗

三聚氰胺作為一種化工原料，廣泛應用于塑料、涂料和濃縮劑的生產(chǎn)中。由于其含氮量高達66.7%,故被一些不法分子添加到乳品、飼料等中虛假夸大蛋白含量。繼2007年美國報道寵物食品中摻雜三聚氰胺導致約4000只貓、狗死亡以來,在其他國家和地區(qū)的飼料中也檢出三聚氰胺。2008年在我國超過5萬名嬰幼兒因食用含三聚氰胺奶粉而患尿路結(jié)石,6名嬰兒死于腎衰竭。三聚氰胺事件引起了全世界對三聚氰胺毒性的研究。急性毒性研究顯示,三聚氰胺毒性作用靶器官是泌尿系統(tǒng),對其他臟器未發(fā)現(xiàn)明顯的損害。有關三聚氰胺的蓄積毒性,以及在急性毒性試驗中是否對其他臟器造成損害尚未見報道,為此本研究通過小鼠急性及蓄積毒性試驗,觀察三聚氰胺對小鼠內(nèi)臟器官的損害作用,為長期毒性、特殊毒性研究和動物中毒治療提供參考。1材料和方法1.1材料表面1.1.1實驗動物昆明種小鼠,清潔級,健康,體重為18g~22g,雌雄各半,購自四川大學動物實驗中心。1.1.2試劑三聚氰胺(純度≥98.5%)為成都市科龍化工試劑廠產(chǎn)品。1.2方法1.2.1小鼠分組及毒種根據(jù)預試驗結(jié)果得知,三聚氰胺小鼠灌胃0%及100%死亡劑量估量值分別為1000mg/kg,15000mg/kg。正式試驗劑量組設為7組,組間劑量比為0.65。按體重隨機分組法將小鼠分為8組,10只/組,雌雄各半。1組~7組為染毒組,第8組為蒸餾水對照組,灌胃染毒。染毒后記錄1周內(nèi)小鼠的中毒表現(xiàn),死亡情況及病理學變化,三聚氰胺LD50及LD5095%可信限按改良寇氏法計算。1.2.2灌胃染毒觀察和大鼠死亡檢測按體重隨機分組法將80只小鼠分為2組,40只/組,雌雄各半。試驗組小鼠每天按1/3LD50的固定劑量連續(xù)灌胃染毒,對照組灌服蒸餾水。在試驗期內(nèi)觀察記錄動物死亡數(shù),當試驗組動物累計死亡達50%,結(jié)束試驗。計算蓄積系數(shù)(K)=LD50(n)/LD50(1),并對結(jié)果進行評價,其中LD50(n)為固定劑量引起受試動物半數(shù)死亡的累計劑量,LD50(1)為1次染毒引起動物半數(shù)死亡的劑量。2結(jié)果2.1急性中毒試驗的結(jié)果2.1.1急性毒性試驗小鼠死亡情況小鼠經(jīng)口染毒6h后,表現(xiàn)為活動減少,精神萎靡,閉眼伏臥,呼吸急促,飲水量及采食量減少等癥狀。42h后最高劑量組小鼠發(fā)生死亡,隨后各劑量組小鼠陸續(xù)死亡,死亡集中在染毒后42h~72h,耐過72h的小鼠不再死亡,但其精神狀態(tài)較差,飲水量和采食量減少。對照組小鼠精神狀態(tài),攝食及活動未見異常,無死亡小鼠。三聚氰胺急性毒性試驗小鼠死亡情況見表1。改良寇氏法計算三聚氰胺小鼠經(jīng)口急性毒性LD50為2958.69mg/kg,LD5095%可信限為2187.00mg/kg~3981.07mg/kg。2.1.2腎遠曲小管相關致病細胞犯罪主要表現(xiàn)為中毒死亡及試驗結(jié)束時存活的小鼠全部處死后做大體解剖,剖檢可見小鼠肺臟表面有出血斑,部分小鼠肺臟萎縮,表面有白色結(jié)節(jié);脾臟體積縮小,脾邊緣有黑紅色出血斑;肝臟腫大,肝表面有樹枝狀或細小長條形出血斑;腎臟腫大,充血出血。上述病變的嚴重程度隨染毒劑量的降低而有所減輕。此外,第1組小鼠膀胱內(nèi)有大量結(jié)石,輸尿管有晶體沉積,隨著劑量的降低,結(jié)石量減少,較低劑量組(第6、7組)小鼠膀胱內(nèi)無結(jié)石,但可觀察到結(jié)晶尿。其他器官未見眼觀病變。組織病理學檢查發(fā)現(xiàn)所有染毒組小鼠肺臟、肝臟、脾臟及腎臟均有病理組織形態(tài)學變化,而對照組小鼠組織形態(tài)無異常變化。圖1為1690mg/kg染毒組小鼠組織器官的病理組織變化。A.肺組織灶性出血(400×);B.肺小葉局部區(qū)域肺泡壁增厚,毛細血管充血,一些肺泡腔內(nèi)有少量紅細胞(200×);C.脾紅髓區(qū)充血出血(200×);D.肝細胞顆粒變性和空泡變性,肝小灶性出血(400×);E.肝細胞彌漫性腫脹、顆粒變性,肝竇變窄,含血量減少,中央靜脈附近的肝細胞腫脹最為嚴重,胞體顯著增大(200×);F.中央靜脈周圍肝細胞紅染HE(200×);G.腎小球體積增大,毛細血管充血,腎小囊腔縮小,腎小管上皮細胞腫脹,遠曲小管中見有染成深藍色的尿液,腎小管之間的小靜脈充血(400×);H.腎遠曲小管見深藍色尿液HE(400×);I.腎髓質(zhì)區(qū)小靜脈顯著擴張充血(400×)A.Lungtissuesshowfocalhaemorrhagia(400×);B.Thealveolarwallthickensinthepulmonarylobule,thebloodcapillaryishyperemia,asmallquantityofredcellsareinsomealveolarcavities(200×);C.Theredpulpsarehyperemiaandhemorrhage(200×);D.Hepatocytesshowgranularandvacuolardegeneration,livertissuesshowfocalhaemorrhagia(400×);E.Hepatocytesshowdiffuseswellingandgranulardegeneration,thesinushepaticiisnarrowandoligohemia,hepatocytesaroundthecentralveinsswellseriously,andcellisenlarged(200×);F.HepatocytesaroundcentralveinsarehomogenicredstainHE(200×);G.Thevolumeofglomcrulusisdilated,thebloodcapillaryshowshyperemia,renalcapsularspaceisnarrow,epithelialcellsinrenaltubuleswell,blueurineisobservedinthedistalconvolutedtubule,venulesbetweentherenaltubulesarehyperemia(400×);H.Blueurineisinthedistalconvolutedtubules(400×);I.Venulesinrenalmedullaareremarkabledilatationandhyperemia(400×)圖1三聚氰胺急性毒性試驗小鼠病理組織學變化(HE)Fig.1Histopathologicallesionsofmiceinacutetoxicitytestofmelamine(HE)2.2蓄積毒性系數(shù)小鼠每天按986.33mg/kg(1/3LD50)染毒劑量連續(xù)染毒,當試驗進行到第12天時,累計死亡小鼠數(shù)達總動物數(shù)的50%(20只/40只),而分次染毒累計劑量為4LD50,故三聚氰胺的蓄積毒性系數(shù)(K)為4。3急性毒性試驗結(jié)果2004年-2007年寵物飼料因污染三聚氰胺導致貓狗急性中毒主要表現(xiàn)為厭食、嘔吐、嗜睡、多尿、氮質(zhì)血癥、高磷酸鹽血癥等腎病癥狀,動物最終死于尿毒癥。死亡動物腎遠曲小管損傷,遠曲小管和集合管有扇形輻射狀結(jié)晶沉積,腎小管上皮細胞發(fā)生壞死和增生。嚙齒類動物急性毒性研究表明,大鼠經(jīng)口急性毒性LD50為3161mg/kg。小鼠急性毒性研究顯示,20000mg/kg劑量組小鼠給藥9h后出現(xiàn)不安,呼吸急促,隨后在幾十分鐘內(nèi)發(fā)生死亡,其余組小鼠僅表現(xiàn)為精神不振,廢食等。死亡小鼠輸尿管有大量晶體蓄積,部分小鼠腎臟被膜有一層晶體,其他臟器未見有明顯的變化。本試驗經(jīng)統(tǒng)計急性毒性試驗小鼠死亡率,計算出三聚氰胺小鼠經(jīng)口急性毒性LD50為2958.69mg/kg,LD50的95%可信限為2187.00mg/kg~3981.07mg/kg,與報道的大鼠LD503161mg/kg非常接近。據(jù)我國食品安全性急性毒性劑量分級標準,三聚氰胺屬低毒級物質(zhì)。盡管三聚氰胺屬低毒級,但其蓄積系數(shù)4,表明其在體內(nèi)有中度蓄積毒性,說明三聚氰胺或其代謝產(chǎn)物能在機體內(nèi)蓄積造成對機體的損害。本次三聚氰胺小鼠灌胃急性毒性試驗各染毒組小鼠均有食欲,飲水量減少,呼吸急促等中毒表現(xiàn),與其他有關小鼠急性中毒癥狀相似。小鼠病理剖檢觀察到小鼠腎臟腫大,表面有出血斑,并未觀察到小鼠腎臟被膜有晶體存在,但在膀胱、輸尿管發(fā)現(xiàn)結(jié)石或結(jié)晶,說明了泌尿系統(tǒng)是三聚氰胺的毒性作用的靶器官。急性毒性試驗經(jīng)3次重復試驗,均觀察到小鼠的肺、肝及脾有相似的病理變化,說明三聚氰胺除對泌尿系統(tǒng)有損傷作用外,對肺臟、肝臟和脾臟也有毒性作用。這是首次報道三聚氰胺經(jīng)口急性毒性會造成對其他內(nèi)臟的損害。組織病理學觀察顯示各染毒劑量組均有形態(tài)學變化。腎臟主要表現(xiàn)為腎小球因毛細血管充血而增大,腎小管上皮腫脹,未觀察到貓、狗急性中毒時的腎遠曲小管和集合管的扇形結(jié)晶和小管上皮的壞死和增生,以及亞急性毒性實驗中觀察到的貓、大鼠腎小管上皮壞死及管腔內(nèi)的晶體。可能的原因是本次試驗甲醛固定病理組織材料時間過長,造成三聚氰胺及其形成結(jié)石溶解于甲醛,故未能觀察到腎