基于線粒體coi基因和核干基因序列的蝶科最大科的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

基于線粒體coi基因和核干基因序列的蝶科最大科的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

蝴蝶是昆蟲(chóng)最具滲透性的物種。它是蝴蝶科美藻科的一個(gè)著名科。目前，12種車道共有550多個(gè)科，分布在古代北部、東部、新熱帶和澳大利亞[2.5]。然而，由于氏族昆蟲(chóng)形態(tài)的多樣性和生活史的不同，該科的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系混亂，這成為昆蟲(chóng)力學(xué)的主題[2.3.06]。關(guān)于該科的起源和發(fā)展的研究的障礙之一是缺乏地質(zhì)數(shù)據(jù)。只有在生物地理事件的背景下才能評(píng)估高級(jí)組之間的差異時(shí)間。這是一項(xiàng)非常重要但具挑戰(zhàn)性的工作。近來(lái),Wahlberg等人[8,11～13]采用分子和形態(tài)數(shù)據(jù)探討了蛺蝶科的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)關(guān)系,認(rèn)為該科為單系類群.結(jié)合當(dāng)時(shí)的化石證據(jù),他們粗略地推測(cè)了蛺蝶科在70百萬(wàn)年前(Ma)就已出現(xiàn),但未給出各亞科分歧時(shí)間的估計(jì)值.鑒此,我們結(jié)合自行測(cè)定的線粒體COI基因和核EF-1α基因序列以及GenBank收錄的序列,應(yīng)用多種統(tǒng)計(jì)方法,估算出蛺蝶科所有12亞科的首次分歧時(shí)間,以期加深對(duì)該科起源和進(jìn)化的認(rèn)識(shí),并對(duì)蝴蝶及其他復(fù)雜類群的時(shí)間估計(jì)問(wèn)題提供依據(jù).1引物、藥物和系統(tǒng)發(fā)育分析(ⅰ)實(shí)驗(yàn)材料.將從四川、云南、廣西等地采集的蛺蝶科閃蛺蝶亞科8個(gè)種(代表8個(gè)屬)和線蛺蝶亞科5個(gè)種(代表5個(gè)屬)活體制成干標(biāo)本(憑證標(biāo)本存于山西大學(xué)昆蟲(chóng)標(biāo)本館),供序列測(cè)定之用.(ⅱ)DNA提取與測(cè)序.取蝶類干標(biāo)本的足用TE(pH9.0)浸泡24h后剪碎,加入含蛋白酶K的溶液(在1倍的TES和1%的SDS中加入0.5mg/mL蛋白酶K)于56℃消化8～12h.消化液采用飽和酚/氯仿法進(jìn)行基因組DNA的抽提.無(wú)水乙醇沉淀DNA完畢用70%的乙醇洗滌,最后溶于30μL的TE(pH8.0)中-20℃保存?zhèn)溆?COI基因擴(kuò)增引物為HCO/LCO和C1-J-2183TL2-N-3014,EF-1α基因擴(kuò)增引物(Starsky/Luke和Cho/Verdi)參照文獻(xiàn).PCR擴(kuò)增采用50μL體系包括50mmol/LKCL,10mmol/LTris(pH8.3),1.5mmol/LMgCl2,0.1%明膠,0.25mmol/LdNTP,0.6μmol/L的各種引物,1.5UTaqDNA聚合酶(華美生物工程公司),以及3μL的模板DNA(包括20～50ngDNA).COI基因擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)變性5min;94℃30s,47℃,30s,72℃,90s,35個(gè)循環(huán);72℃10min.EF-1α基因的擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)變性7min;95℃,1min,55℃,1min,72℃,2min,35個(gè)循環(huán);72℃,10min.擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)華舜PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化,純化產(chǎn)物由大連寶生物公司進(jìn)行測(cè)序.(ⅲ)系統(tǒng)發(fā)育分析.所測(cè)序列經(jīng)校對(duì)后投送GenBank,蛺蝶科其余10個(gè)亞科43個(gè)種的序列由GenBank下載,詳見(jiàn)表1.COI和EF-1α基因序列分別用ClustalX1.83軟件進(jìn)行多重對(duì)位排列分析,并輔以手工校正;利用PAUP*4.0b4a軟件對(duì)兩個(gè)已排列矩陣進(jìn)行分劃同質(zhì)性檢測(cè)(partitionhomogeneitytest),由于P<0.001(重復(fù)1000次抽樣),表明兩個(gè)基因合并后不宜用最大簡(jiǎn)約法(maximumparsimony,MP)進(jìn)行分析需要采用最大似然法(maximumlikelihood,ML)來(lái)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù);選擇彌尺蛾屬Archiearisparthenias作為外類群,采用RAxML7.0.0軟件構(gòu)樹(shù),最佳核苷酸置換模型(GTR+I+Γ)由Modeltest3.7確定;數(shù)據(jù)自展(bootstrap)次數(shù)均為1000.(ⅳ)分歧時(shí)間估計(jì).分別應(yīng)用相對(duì)速率檢驗(yàn)法和似然比檢驗(yàn)法檢測(cè)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)各分支間核苷酸置換速率的差異顯著性:用PAUP*軟件對(duì)各分支間的進(jìn)化速率進(jìn)行似然比檢驗(yàn),2?l和χ271分布(P<0.001)表明存在顯著性差異,即嚴(yán)格分子鐘假設(shè)不成立;用RRTREE軟件檢測(cè)各分支間的相對(duì)速率,得到類似結(jié)果.因而,不能采用簡(jiǎn)單的線性擬合來(lái)估計(jì)各亞科間的分歧時(shí)間.基于寬松分子鐘條件,采用貝葉斯馬爾可夫鏈蒙特卡羅(MCMC)算法估計(jì)分歧時(shí)間.在描述化石標(biāo)定的不確定性時(shí),一并考慮任意分布.核苷酸置換模型為HKY85+Γ5,用PAML軟件包中的MCMC-TREE程序分析數(shù)據(jù).選擇獨(dú)立速率模型,由物種抽樣的生-滅過(guò)程確定分歧時(shí)間的先驗(yàn)值.本研究采用6個(gè)化石標(biāo)定,其中4個(gè)屬蛺蝶亞科,分別為34Ma的紅蛺蝶屬Vanessaamerindica,與斑蛺蝶屬相關(guān)的兩個(gè)已滅絕物種Prodryaspersephone和Lithopsychestyx以及14Ma的麻蛺蝶屬.第5個(gè)是發(fā)生于中新世的Dynaminealexaen.最后一個(gè)化石的年代鑒定為始新世中期(約48～51Ma),其所代表的物種應(yīng)屬眼蝶亞科,與Elyminiini中物種相近.通過(guò)符合上下限界的Γ分布確定6個(gè)化石標(biāo)定分別代表2.5%和97.5%的分布密度.在去除10000次重復(fù)后,MCMC程序重復(fù)運(yùn)行200000次.在每次分析中,算法用不同初始值運(yùn)算兩次以確認(rèn)收斂于同一后驗(yàn)值.此外,采用BEASTv1.4.6軟件將各物種按照其所屬亞科的不同分別設(shè)置了相應(yīng)的亞類群,并對(duì)亞類群進(jìn)行了自動(dòng)優(yōu)化處理.2蝶科各科之間的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)關(guān)系傳統(tǒng)分類學(xué)主要依據(jù)蛺蝶科各亞科物種形態(tài)、生活史及其寄主植物等可觀察到的特征作為分類學(xué)的重要依據(jù).但由于該科內(nèi)各亞科物種形態(tài)學(xué)和生態(tài)學(xué)特征較為復(fù)雜,因而不同的分類學(xué)者依據(jù)不同的分類特征得到的分類系統(tǒng)存在較多爭(zhēng)議.1991年Harvey將蛺蝶科分為13個(gè)亞科,分別為袖蛺蝶亞科、蛺蝶亞科、線蛺蝶亞科、螯蛺蝶亞科、閃蛺蝶亞科、眼蝶亞科、摩爾福蝶亞科、絹蛺蝶亞科、斑蝶亞科、科科科蝶亞科、科斑蝶亞科、﹑蛺蝶亞科以及Tellervinae.國(guó)內(nèi)蛺蝶科研究則主要依據(jù)周堯在《中國(guó)蝶類志》中描述的分類系統(tǒng),包括10個(gè)亞科,分別為螯蛺蝶亞科、釉蛺蝶亞科、閃蛺蝶亞科、秀蛺蝶亞科、科蛺蝶亞科、線蛺蝶亞科、﹑蛺蝶亞科、科蛺蝶亞科、蛺蝶亞科以及絹蛺蝶亞科.此外,該分類系統(tǒng)中眼蝶亞科和斑蝶亞科被分類為眼蝶科和斑蝶科.多年來(lái),該科各亞科的分類系統(tǒng)曾經(jīng)過(guò)多次修正,目前國(guó)際較為公認(rèn)的分類系統(tǒng)包括12個(gè)亞科,分別為袖蛺蝶亞科、蛺蝶亞科、線蛺蝶亞科、螯蛺蝶亞科、閃蛺蝶亞科、絹蛺蝶亞科、眼蝶亞科、科蛺蝶亞科、秀蛺蝶亞科、斑蝶亞科、喙蝶亞科以及苾蛺蝶亞科.盡管當(dāng)前對(duì)于蛺蝶科各物種的研究較多,但是蛺蝶科各亞科之間的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)關(guān)系尚缺乏系統(tǒng)研究.因此,得到蛺蝶科各亞科之間的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)關(guān)系是根據(jù)現(xiàn)有化石估計(jì)各亞科分歧時(shí)間的前提.根據(jù)最大似然法得出的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)顯示大部分物種均以較高自展支持率各自聚為相應(yīng)的亞科分支.除眼蝶亞科外其余11個(gè)亞科分支的自展支持率均在82%以上,部分分支在90%以上,其中斑蝶亞科、螯蛺蝶亞科、閃蛺蝶亞科、袖蛺蝶亞科、線蛺蝶亞科、科蛺蝶亞科和﹑蛺蝶亞科各分支的自展支持率達(dá)95%以上,支持這些亞科為單系類群;喙蝶亞科位于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的基部,袖蛺蝶亞科與線蛺蝶亞科以及眼蝶亞科、螯蛺蝶亞科與絹蛺蝶亞科分別以100%的自展支持率各自聚為一支.閃蛺蝶亞科與蛺蝶亞科聚為一支,隨后與科蛺蝶亞科與苾蛺蝶亞科形成的分支相聚,秀蛺蝶亞科的物種再同這4個(gè)亞科以較高自展支持率(90%)形成一個(gè)聚類簇.總的來(lái)說(shuō),我們用最大似然法獲得的蛺蝶科系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)與根據(jù)前人研究獲得的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)除絹蛺蝶亞科的系統(tǒng)發(fā)育位置有所不同外,其余各亞科的系統(tǒng)發(fā)育位置和各亞科間的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)關(guān)系較為一致,為進(jìn)一步估計(jì)蛺蝶科各亞科間的分歧時(shí)間關(guān)系奠定了基﹑.根據(jù)MCMCTREE軟件的計(jì)算結(jié)果,圖1顯示了蛺蝶科各亞科首次分歧時(shí)間的﹑均估計(jì)值及95%置信區(qū)間,其中蛺蝶科的首次時(shí)間分歧約為87.1Ma其95%置信區(qū)間為(68.9,120.7),與Walhberg根據(jù)化石﹑料和地質(zhì)事件發(fā)生所估計(jì)的蛺蝶科年齡應(yīng)>70Ma的結(jié)果相一致.基于分子證據(jù)和統(tǒng)計(jì)方法,估計(jì)出斑蝶亞科與其他亞科的分歧時(shí)間為71.0(60.487.4)Ma,螯蛺蝶亞科與眼蝶亞科的分歧時(shí)間為53.9(50.2,59.2)Ma,秀蛺蝶亞科與科蛺蝶亞科、苾蛺蝶亞科、閃蛺蝶亞科及蛺蝶亞科等4個(gè)亞科的分歧時(shí)間為49.8(45.6,59.4)Ma,閃蛺蝶亞科與蛺蝶亞科的分歧時(shí)間為44.2(39.0,49.0)Ma,線蛺蝶亞科與袖蛺蝶亞科的分歧時(shí)間為48.6(43.0,58.3)Ma,科蛺蝶亞科與﹑蛺蝶亞科的分歧時(shí)間為44.4(39.8,49.4)Ma.綜上所述,本研究所獲得的蛺蝶科所有12個(gè)亞科間首次分歧時(shí)間的﹑均估計(jì)值為44.2～87.1Ma.我們用BEASTv1.4.6軟件計(jì)算也獲得了類似的結(jié)果,表明上述估計(jì)較為穩(wěn)定可靠.迄今為止,世界范圍內(nèi)從古新世到中新世所發(fā)現(xiàn)的蝴蝶成蟲(chóng)形成的化石約有50個(gè),其中33個(gè)與現(xiàn)存蝶類物種相同.由于各方面條件所限,目前所發(fā)現(xiàn)的蝴蝶化石只占化石記錄的很少部分,這給我們分析蝴蝶種群