持續(xù)性壓力培養(yǎng)環(huán)境對兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響

持續(xù)性壓力培養(yǎng)環(huán)境對兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響【摘要】［目的］探討持續(xù)性壓力培養(yǎng)環(huán)境對兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響，揭示持續(xù)壓力致假體松動下沉進(jìn)展及其術(shù)后活動影響的生物學(xué)機(jī)制。［方法］以新西蘭兔的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，通過四唑鹽比色試驗(yàn)，觀察壓力對骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響。［結(jié)果］骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在20、60、100kPa持續(xù)性壓力培養(yǎng)環(huán)境下MTT反應(yīng)的OD值顯著小于對照組，壓力值越大,OD值越小。20、60、100kPa持續(xù)性壓力可顯著抑制骨髓基質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞增殖,抑制作用隨壓力值增大而增強(qiáng)。［結(jié)論］關(guān)節(jié)置換術(shù)后早期患者不宜過早下地，否則將產(chǎn)生持續(xù)性應(yīng)力，可以引起骨髓腔內(nèi)骨髓干細(xì)胞的抑制，不利于骨質(zhì)愈合。且易產(chǎn)生假體下沉和松動。

【關(guān)鍵詞】骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；持續(xù)性壓力；髖關(guān)節(jié)置換；細(xì)胞增殖

Abstract：［Objective］Toinvestigatetheinfluenceofpressureontheproliferationofrabbitbonemarrowstromalcells(MSCs)andexplaintherelationshipofthehipprosthesissubmergeandlooseningwithcontinuouspressureafterrevisionoftotalhipreplacement.［Method］AunitofMSCspressuremodelwassetuptoloaddifferentpressuresonMSCsculturedinvitro.［Result］MSCsshowedmoreproliferationcapacityunderdiscontinuouspressure.MTTassaywasusedtodeterminethecellproliferationofprimarilyculturedMSCsunderdiscontinuouspressure.TheMSCsODvalueofpressuredgroupswasmuchsmallerthanthecontrolgroupatdifferenttimes.VariousmagnitudesanddurationsofthediscontinuouspressurecouldsignificantlysuppressMSCsproliferationwiththemagnitude-dependent.［Conclusion］Attheearlyperiodafterrevisionoftotalhipreplacement,patientsshouldlieandexerciseonthebeduntil6weeks.Otherwise,theweight-bearingpressuremayrestrainMSCsproliferationwhichisharmfultounionandmaycauseprosthesissubmergeandloose.

Keywords：bonemarrowstromalcells;continuouspressure;revisionoftotalhipreplacement;cellproliferation

骨髓基質(zhì)干細(xì)胞來源的成骨細(xì)胞是骨髓腔內(nèi)主要的受力細(xì)胞，在人工關(guān)節(jié)置換病例中，其生命活動狀況與假體傳導(dǎo)壓力有密切關(guān)系，本文應(yīng)用可控壓力細(xì)胞加載裝置和通過四唑鹽比色試驗(yàn)，觀察壓力對骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響，以期為揭示持續(xù)壓力致假體松動下沉進(jìn)展及其術(shù)后活動影響的生物學(xué)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

實(shí)驗(yàn)儀器

超凈工作臺CO2培養(yǎng)箱YMT-Z倒置顯微鏡DG3022型酶聯(lián)免疫檢測儀實(shí)驗(yàn)材料:無血清DMEM培養(yǎng)液,含10%FBS的DMEM25ml,100ml培養(yǎng)瓶，24孔,96孔培養(yǎng)板(Gibco),含2%FBS的DMEM胎牛血清，噻唑藍(lán)胰蛋白酶，ABC試劑盒

實(shí)驗(yàn)方法

兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)出生1月的新西蘭兔1只，斷頭處死，無菌條件下取四肢長骨，縱行剖開，用DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，輕輕吹打，靜置1min，使大塊組織沉降，取上清接種于10個25ml培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。24h后換液，去除未貼壁的血細(xì)胞，以后每3d換液1次，細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底部后，用％胰酶常規(guī)傳代，傳代比例為1：3。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長情況。

礦化結(jié)節(jié)染色：取第3代細(xì)胞，胰酶消化，接種在25ml培養(yǎng)瓶中，用礦化液(含20%胎牛血清、2nmol/Lβ-甘油磷酸鈉、50μg/ml維生素、10nmol/L地塞米松)連續(xù)培養(yǎng)30d,在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察礦化結(jié)節(jié)的形成情況。取30d標(biāo)本，95％酒精固定后行Von-Kossa染色，觀察礦化結(jié)節(jié)的形成情況。

細(xì)胞加載裝置本實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞加載裝置是可控壓力細(xì)胞加載裝置。該裝置由高壓儲氣室、控壓加載室、氣流量調(diào)控器、壓力檢測器、計(jì)時器所組成。高壓儲氣室儲備5%CO2，95%空氣，氣壓大于MPa?？貕杭虞d室通過氣流量調(diào)控器與高壓儲氣室連接，并由壓力檢測器和氣流量調(diào)控器控制加載室室內(nèi)壓力，室內(nèi)壓力與設(shè)定壓力之誤差小于５％。

細(xì)胞加載方法按實(shí)驗(yàn)方案設(shè)定調(diào)試控壓加載室氣壓值。將細(xì)胞培養(yǎng)板放入加載室內(nèi)，關(guān)閉室門。再開啟氣流量調(diào)控器向加載室充氣加壓并計(jì)時。到達(dá)預(yù)定加載時間后，通過排氣閥排氣減壓并打開室門。接受加載后的細(xì)胞重新放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)或加入試劑染色以觀察數(shù)量。

分組將生長良好的第3、4代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞按1X104個/孔隨機(jī)接種于7塊24孔培養(yǎng)板，14h后細(xì)胞完全貼壁,換新鮮含10%FCS的DMEM。按壓力施加類型不同分為持續(xù)性和間歇性壓力，每塊培養(yǎng)板的細(xì)胞為１大組，本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)將4塊培養(yǎng)板分為4個大組即:對照組、20kPa持續(xù)組、60kPa持續(xù)組、100kPa持續(xù)組。每大組按觀察期分為1、3、5、7d4個小組。每小組樣本為6孔。對照組不予加壓，20、60、100kPa組分別在規(guī)定的時間內(nèi)每天施以20、60、100kPa的持續(xù)3h壓力。

骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的存活和增殖的檢測方法在規(guī)定的觀察期，分別給相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)小組加入60μl，繼續(xù)孵育4h后吸棄孔內(nèi)液體備檢。當(dāng)各組觀察期的反應(yīng)均完成后，每孔加入二甲基亞砜600μl，充分振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔細(xì)胞490nm波長的光吸收值。

數(shù)據(jù)處理

各組光吸收均值用spss配對t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

細(xì)胞生長狀況

原代培養(yǎng)后，細(xì)胞在第5～7d內(nèi)可見細(xì)胞從組織塊邊緣游出，以組織塊為中心成放射狀向外排列。細(xì)胞呈長梭形，伸展良好，胞體豐滿，胞漿均勻，5代以前細(xì)胞生長旺盛，生長狀態(tài)良好。礦化結(jié)節(jié)染色陽性(見圖2)。

不同觀察期骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的OD值變化：自實(shí)驗(yàn)第1d起，各實(shí)驗(yàn)組骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的OD值逐漸升高。觀察期越長，OD值越高。實(shí)驗(yàn)組OD值小于對照組OD值。

持續(xù)壓力對骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的OD值的影響

表1骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在不同壓力持續(xù)作用下的OD值

*表示各壓力組OD值均數(shù)顯著低于對照組，

＃表示60kPa組、100kPa組OD值均數(shù)顯著低于20kPa組，

△表示100kPa組OD值均數(shù)顯著低于60kPa組，

不同持續(xù)壓力條件下骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的OD值變化(表1)：實(shí)驗(yàn)的第3d，20kPa組與60kPa組OD值均數(shù)之間無顯著差異，但均高于100kPa組；實(shí)驗(yàn)的第5d，不同壓力組OD值均數(shù)之間差異顯著，壓力越高，OD值越低；實(shí)驗(yàn)的第7d，壓力較大組的OD值均數(shù)低于壓力較小組，。

圖1原代約7d細(xì)胞即可長滿，外觀為梭形、三角形

圖2原代培養(yǎng)4周左右可見白色結(jié)節(jié)形成

3討論

髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后經(jīng)常發(fā)生假體松動、下沉、移位甚至脫落，是關(guān)節(jié)翻修手術(shù)重要因素之一。假體安裝或者設(shè)計(jì)不當(dāng)都會使骨組織受到不良的應(yīng)力作用，也可使骨質(zhì)破壞。關(guān)節(jié)外科所開展的生物力學(xué)研究，多偏重于闡明不同假體設(shè)計(jì)對股骨及其支持組織的應(yīng)力分布產(chǎn)生何種影響。由于骨組織生物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，假體接觸應(yīng)力將引起骨組織應(yīng)力細(xì)胞的變化情況及其機(jī)理，仍然是個值得探索的新領(lǐng)域。

有實(shí)驗(yàn)報(bào)道，機(jī)械性應(yīng)力應(yīng)變是骨骼構(gòu)建與重塑的基本動因［1］。適宜的應(yīng)力環(huán)境可以促進(jìn)骨代謝朝著最佳水平發(fā)展，反之則可導(dǎo)致不良后果。骨骼內(nèi)的某些細(xì)胞能夠感知生物物理性信號，加工整合這些信號，并將之轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的骨骼結(jié)構(gòu)變化。細(xì)胞的這一功能被稱為力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能［1］。這表明在骨骼的功能適應(yīng)性機(jī)制中，力學(xué)現(xiàn)象與骨骼的構(gòu)建、重塑是通過細(xì)胞的功能性變化而直接聯(lián)系起來的。這些具有力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的細(xì)胞，由于它們對力學(xué)刺激敏感，故又稱其為力學(xué)敏感性細(xì)胞。成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分別是骨骼形成和吸收的效應(yīng)性細(xì)胞。成骨細(xì)胞是骨骼中最重要的活性細(xì)胞，一般認(rèn)為該細(xì)胞是力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中對應(yīng)力應(yīng)變信號進(jìn)行感知的感受性細(xì)胞，同時作為效應(yīng)性細(xì)胞增強(qiáng)骨骼的形成。

細(xì)胞加載裝置是研究體外活細(xì)胞對應(yīng)力效應(yīng)的先決條件。1985年Benase使用細(xì)胞牽張加載裝置,通過彈性硅膠膜形變使所貼附的細(xì)胞受力，觀察細(xì)胞在周期性牽拉作用下的變化。該系統(tǒng)對檢測肌細(xì)胞、韌帶細(xì)胞、骨細(xì)胞在張力作用下的反應(yīng)發(fā)揮了重要作用，但其加載載荷的范圍受彈性硅膠膜的性能和面積限制，且細(xì)胞受力的狀況有可能受細(xì)胞對彈性硅膠膜粘附效果的影響。細(xì)胞液壓加載裝置［3］的問世為研究定量壓力條件下的細(xì)胞力學(xué)反應(yīng)提供了可能。

骨髓基質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化來的成骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)置換手術(shù)后主要的應(yīng)力細(xì)胞，同時具有合成膠原形成膠原纖維，分泌重要的活性物質(zhì)以調(diào)控骨內(nèi)組織的代謝等功能。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞生活在骨髓腔中,該組織既是細(xì)胞物質(zhì)交換的媒體又是傳遞和緩沖應(yīng)力的介質(zhì)。假體受力發(fā)生位移的同時，必然擠壓骨內(nèi)松質(zhì)骨的組織液致使其組織液液壓亦即骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的受力改變。因此，通過改變液壓的方式實(shí)施對骨髓基質(zhì)干細(xì)胞加載能比較好地模擬臨床關(guān)節(jié)置換術(shù)后實(shí)際。本實(shí)驗(yàn)所用的可控壓力細(xì)胞加載裝置是在Yousefian［2］裝置基礎(chǔ)制作的。該細(xì)胞力學(xué)模型的建立，為進(jìn)一步探索和揭示關(guān)節(jié)置換假體下沉的細(xì)胞和分子生物學(xué)機(jī)理提供了條件。

應(yīng)力對成骨細(xì)胞增殖的效應(yīng)雖有報(bào)導(dǎo)，但結(jié)論并不一致。Ozawa等則通過向壓力培養(yǎng)箱持續(xù)注入三種持續(xù)加壓的混合空氣,作用于鼠成骨樣細(xì)胞持續(xù)性壓力，證實(shí)持續(xù)性壓力對成骨細(xì)胞有抑制作用［3］。

本研究用可控壓力細(xì)胞加載裝置和MTT法觀察了體外環(huán)境下正壓力對骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響，在體外培養(yǎng)環(huán)境下觀察壓力對骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響。取第3～4代原代培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，應(yīng)用可控壓力細(xì)胞加載裝置分別持續(xù)性施加20、60、100kPa的壓力,分別在培養(yǎng)的第1、3、5、7d用MTT法測定各組的OD值。

表1證實(shí)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在20、60、100kPa持續(xù)性壓力培養(yǎng)環(huán)境下，MTT反應(yīng)的OD值顯著小于對照組，壓力值越大,OD值越小。20、60、100kPa持續(xù)性壓力可顯著抑制骨髓基質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞增殖,該抑制作用隨壓力值增大而增強(qiáng)。發(fā)現(xiàn)自實(shí)驗(yàn)第3d起，持續(xù)性壓力各實(shí)驗(yàn)組骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的OD值逐漸升高，觀察期越長，OD值越高，其中對照組骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的OD值升高幅度顯著大于加壓組。由于MTT比色法是基于活細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶使外源性MTT還原為難溶性藍(lán)紫色結(jié)晶物沉積于細(xì)胞內(nèi)，且該結(jié)晶被DMSO溶解并在酶聯(lián)免疫檢測儀顯色，其OD值間接反應(yīng)被檢樣本內(nèi)的活細(xì)胞數(shù)的原理，因此，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)３d20kPa以上持續(xù)性壓力作用后，其增殖受到明顯的抑制，并且該壓力抑制作用具有時間效應(yīng)。

據(jù)Kletsas［4,5］報(bào)導(dǎo)，成骨細(xì)胞牽張力作用1-6h后就可以出現(xiàn)DNA合成活躍。而本文實(shí)驗(yàn)的第1d，壓力組骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的OD值與對照組之間并無顯著差異。這表明若從細(xì)胞學(xué)水平觀察壓力對骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的效應(yīng)，其效應(yīng)出現(xiàn)在接受刺激的1d之后。

比較不同持續(xù)性壓力條件下骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的OD值變化可見，實(shí)驗(yàn)的第３d20kPa組與60kPa組OD值均數(shù)之間無顯著差異；實(shí)驗(yàn)的第７d，不同壓力組組間OD值均數(shù)的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著；而實(shí)驗(yàn)第５d，不同壓力組OD值均數(shù)間差異顯著，這提示壓力對骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)并不完全是直線型的。

本實(shí)驗(yàn)提示臨床關(guān)節(jié)置換術(shù)后，早期下地產(chǎn)生的持續(xù)性應(yīng)力，會明顯引起骨髓腔內(nèi)骨髓干細(xì)胞增殖的抑制，不利于骨的重建愈合，更易產(chǎn)生假體下沉和松動。

【參考文獻(xiàn)】

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