分子生物學：DNA重組和重組DNA技術

DNA重組和重組DNA技術DNARecombination第二十一章DNA重組（DNArecombination）是指不同DNA分子斷裂和連接而產(chǎn)生DNA片段的交換并重新組合形成新DNA分子的過程。重組DNA技術（recombinantDNAtechnology）是指在體外將兩個或兩個以上DNA分子重新組合并在適當細胞中增殖形成新DNA分子的過程。第二節(jié)

重組DNA技術RecombinantDNATechnology人體生長激素釋放激素(SS)抑制和調(diào)節(jié)多種激素的作用從動物腦中提取:5mg---50萬只羊腦基因工程9升大腸桿菌培養(yǎng)液重組DNA技術的發(fā)展史1944年O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗。1973年美國斯坦福大學的科學家構建第一個重組DNA分子。1977年美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應用重組DNA技術制造醫(yī)學上重要的藥物。1980年開始建造第一家應用重組DNA技術生產(chǎn)胰島素的工廠。1997年英國羅林研究所成功的克隆了多莉。重組DNA技術相關概念克隆(clone):來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。DNA克隆技術水平：分子克隆(molecularclone)

（即DNA克隆）

細胞克隆個體克隆（動物或植物）

其主要過程包括：在體外將目的DNA片段與能自主復制的遺傳元件（又叫載體）連接，形成重組DNA分子，進而在受體細胞中復制、擴增，從而獲得單一DNA分子的大量拷貝。重組DNA技術，又稱分子克隆（molecularcloning）或DNA克?。―NAcloning）或基因工程（geneticengineering）技術

目的：①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）一、重組DNA技術中常用的工具酶

限制性核酸內(nèi)切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆轉(zhuǎn)錄酶

T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶重組DNA技術中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ①合成雙鏈cDNA分子或片段連接；②缺口平移制作高比活探針；③

DNA序列分析；④填補3

末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5

3

聚合、35

外切活性，而無53

外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標記等反轉(zhuǎn)錄酶①合成cDNA；②替代DNA聚合酶I進行填補，標記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5

羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3

羥基末端進行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)

限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是一類核酸內(nèi)切酶，能識別雙鏈DNA分子內(nèi)部的特異序列,并裂解磷酸二酯鍵。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ定義：與甲基化酶共同構成細菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護自身DNA。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術中常用Ⅱ型）分類：作用：第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名：HindⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶Ⅱ類酶識別序列特點——

回文結構(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口黏端切口有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍末端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA

同尾酶來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱同裂酶或同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同裂酶：

DNA連接酶(基因工程的“縫紉針”)1.T4噬菌體DNA連接酶：兩個不同片段雙鏈DNA存在互補粘性末端（Km=0.6μmol/L)或平末端(Km=50μmol/L)。DNA連接反應都是由T4DNA連接酶介導2.大腸桿菌DNA連接酶:不能催化平末端DNA分子的連接DNA聚合酶1.大腸桿菌DNA聚合酶I及其大片段(Klenow片段):

大腸桿菌DNA聚合酶I具有三種酶活性。2.TaqDNA聚合酶:耐熱（75-80℃），分子量65kD,也具5’

3’外切酶活性。反轉(zhuǎn)錄酶(RDDP):多功能酶，無3’

5’DNA外切酶活性，具有3’

5’RNA外切酶活性。

二、重組DNA技術中常用的載體

定義為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。

載體按功能分為

克隆載體(cloningvector)

表達載體(expressionvector)

克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設計的載體稱為克隆載體。表達載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設計的載體稱為表達載體。（一）克隆載體至少有一個復制起點使載體在宿主細胞中進行自主復制，并能使克隆的外源DNA片段得到同步擴增；至少有一個選擇標志（selectionmarker）：選擇標志是區(qū)分含與不含載體的細胞所必需的，包括抗生素抗性基因、β-半乳糖苷酶基因（lacZ）、營養(yǎng)缺陷耐受基因等。有適宜的RE的單一切點：載體中一般都構建有一段特異性核苷酸序列，在這段序列中包含了多個RE的單一切點，可供外源基因插入時選擇，叫多克隆位點（multiplecloningsites，MCS）。1.克隆載體應具備的基本特點

（1）質(zhì)粒

(plasmid)特點:能在宿主細胞內(nèi)獨立自主復制；帶有某些遺傳信息,會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。2.常用的克隆載體

pUC18質(zhì)粒載體圖譜

λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)

λgt系列（插入型，適用cDNA克?。?/p>

EMBL系列（置換型，適用基因組克?。?）噬菌體(phage)

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）

M13mp系列

pUC系列柯斯質(zhì)粒（cosmid）載體（又稱黏粒載體）

酵母人工染色體

(yeastartificialchromosome,YAC)

細菌人工染色體

(bacterialartificialchromosome,BAC)

動物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）（3）其他克隆載體病毒載體

近年來為適應真核細胞DNA重組技術的需要，已發(fā)展了用動物病毒（如腺病毒及反轉(zhuǎn)錄病毒等）改造的病毒載體。目前常用的病毒載體有兩類：整合型和游離型。整合型載體可整合到宿主細胞的染色體上，并隨染色體的復制而復制，可持續(xù)表達外源基因，但存在插入誘變的危險。游離型載體并不整合到宿主染色體DNA上，而是游離于染色體外瞬時表達外源基因，有較好的安全性。（一）反轉(zhuǎn)錄病毒載體反轉(zhuǎn)錄病毒為單正鏈RNA病毒，可高效感染許多類型的宿主細胞，并穩(wěn)定整合到宿主細胞染色體上，是最先被改造且應用最為廣泛的基因治療載體。（二）腺病毒載體腺病毒是無包膜的線性雙鏈DNA病毒。（二）表達載體表達載體是指用來在宿主細胞中表達外源基因的載體。根據(jù)宿主細胞分為：原核表達載體真核表達載體1.原核表達載體

原核表達載體的基本組成

R：調(diào)節(jié)序列；P：啟動子；SD：SD序列；TT：轉(zhuǎn)錄終止序列2.真核表達載體

真核表達載體的基本組成

OriPro：原核復制起始序列；P：啟動子；MCS：多克隆位點；

TT：轉(zhuǎn)錄終止序列；orieuk：真核復制起始序列。第三節(jié)重組DNA技術基本原理和操作步驟重組DNA技術操作過程可形象歸納為：分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體

轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體細胞篩篩選重組體

目的基因基因載體重組體分切接轉(zhuǎn)篩表總體技術路線基本原理目的基因的獲取DNA導入受體細胞外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構建重組體的篩選克隆基因的表達

以質(zhì)粒為載體的DNA

克隆過程（一）目的基因的分離獲取——分化學合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。從基因組DNA文庫和cDNA文庫中獲取目的DNA(見第20章)PCR法(見第20章)其他方法(見第20章)化學合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列。組織或細胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合從基因組DNA文庫獲取目的基因構建基因組DNA文庫的基本過程

限制酶切位點限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫用隨機切割的真核生物染色體DNA片段構建基因文庫mRNAcDNA

雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫

反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復制

從cDNA文庫獲取目的基因逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT（二）載體的選擇與構建——選目的不同，操作基因的性質(zhì)不同，載體的選擇和改建方法也不同。

目的：①獲得某一目的基因或DNA片段②獲得目的DNA片段所編碼的蛋白質(zhì)載體插入DNA片段宿主細胞質(zhì)粒<5~10kb細菌，酵母λ噬菌體載體~20kb細菌黏粒~50kb細菌BAC~400kb細菌YAC~3Mb酵母不同載體的克隆容量及適宜宿主細胞（三）目的DNA與載體連接——接方式：（1）單一相同黏端連接（2）不同黏端連接

（3）通過其他措施產(chǎn)生黏端進行連接

黏端連接BamHⅠ切割反應

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連單一相同黏端連接不同黏端連接（定向克隆）EcoRⅠ切割位點Bg

lⅡ切割位點+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進行粘端連接。

人工接頭(linker)連接通過其他措施產(chǎn)生黏端進行連接人工接頭及其應用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。

同聚物加尾連接5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體5′PCR法針對目的DNA的5

-和3

-端，設計一對特異引物，在每條引物的5

-端分別加上不同的RE位點，然后以目的DNA為模板，經(jīng)PCR擴增便可得到帶有引物序列的目的DNA，再用相應RE切割PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生黏端，隨后便可與帶有相同黏端的線性化載體進行有效連接。平端連接

限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補齊或切平形成的平端適用于：目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連3.粘-平末端連接黏-平末端連接是指目的DNA和載體之間通過一端為黏端、另一端為平端的方式進行連接。

屬于定向克隆受體菌條件：安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導入方式：轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)染(transfection)感染(infection)（四）重組DNA轉(zhuǎn)入受體細胞——轉(zhuǎn)1.借助載體上的遺傳標志進行篩選

(1)利用抗生素抗性標志篩選(2)利用基因的插入失活/插入表達特性篩選(3)利用標志補救篩選(4)利用噬菌體的包裝特性進行篩選（五）重組體的篩選與鑒定——篩2.序列特異性篩選

(1)RE酶切法(2)PCR法

(3)核酸雜交法(4)DNA測序法

3.親和篩選法插入失活篩選帶有重組載體的克隆α互補篩選（藍-白篩選）菌落或噬斑原位雜交篩選重組體重組DNA技術操作過程可形象歸納為：小結分分離獲取目的基因選載體的選擇與構建接目的DNA與載體連接

轉(zhuǎn)重組DNA轉(zhuǎn)入受體細胞篩重組體的篩選與鑒定重組DNA技術操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNA

cDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交表達體系的建立：表達載體的構建受體細胞的建立表達產(chǎn)物的分離純化（六）克隆基因的表達

標準：選擇標志 強啟動子翻譯調(diào)控序列 多接頭克隆位點

E.coli表達體系的不足：不宜表達真核基因組DNA；不能加工表達的真核蛋白質(zhì)；表達的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體(inclusionbody)

；很難表達大量可溶性蛋白。1.原核表達體系(E.coli表達體系最為