中藥復(fù)方砂仁中揮發(fā)油成分的多指標(biāo)均勻設(shè)計(jì)提取工藝分析

中藥復(fù)方砂仁中揮發(fā)油成分的多指標(biāo)均勻設(shè)計(jì)提取工藝分析

砂仁是姜科植物陽春砂的特征。它是綠色殼砂的特征。l.wethyen和海南砂的特征。拉米星。l.w干燥成熟的水果是廣東省陽春縣產(chǎn)的最著名的所謂南藥沙地。砂仁性辛、溫,歸脾、胃、腎經(jīng),有化濕開胃、溫脾止瀉、理氣安胎之功效,用于治濕濁中阻、脘痞不饑、脾胃虛寒、嘔吐泄瀉、妊娠惡阻、胎動(dòng)不安等。砂仁主含揮發(fā)油,但揮發(fā)油為混合物,組成和性質(zhì)均不穩(wěn)定,揮發(fā)油成分的高低及其提取效果直接影響著砂仁的藥用價(jià)值。目前對(duì)砂仁中揮發(fā)油提取方法涉及到水蒸氣蒸餾、超臨界萃取、溶劑熱萃取法、固相微萃取、微波萃取等,采用GC-MS分析鑒定揮發(fā)油中成分及相對(duì)含量。提高揮發(fā)油的提取率可提高藥材利用率,這是提取工藝研究的重要目標(biāo),僅以總揮發(fā)油含量難以保證砂仁的品種與質(zhì)量,應(yīng)增設(shè)揮發(fā)油主要成分含量作指標(biāo)依據(jù)控制砂仁藥材質(zhì)量。為此,我們采用水蒸氣蒸餾法提取砂仁揮發(fā)油,選用均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)表U9(94),對(duì)提取時(shí)間、浸泡時(shí)間、溶劑量、粉碎度進(jìn)行均勻?qū)嶒?yàn),將得到的揮發(fā)油進(jìn)行GC-MS分析,揭示因素與砂仁揮發(fā)性成分結(jié)構(gòu)分布及相對(duì)含量的關(guān)系,從而提出充分保存揮發(fā)成分前提下提取砂仁油的適宜的條件。1材料和機(jī)器1.1植物陽春砂、生物酶砂仁藥材,購自廣州清平藥材市場,產(chǎn)地:廣東,經(jīng)廣東藥學(xué)院中藥鑒定教研室李書淵教授鑒定為姜科植物陽春砂AmomumvillosumLour.的干燥成熟果實(shí);無水乙醚、無水硫酸鈉,均為分析純;水為自制超純水。1.2儀器和試劑HP5890GC/HP5972MS氣/質(zhì)聯(lián)用儀(美國安捷倫公司),1μl微量進(jìn)樣器(上海安亭科學(xué)儀器廠),AY120型電子分析天平(上海島津商貿(mào)有限公司),TC-15型恒溫電熱套(海寧市華星儀器廠)。2方法和結(jié)果2.1揮發(fā)油的提取將砂仁藥材粉碎,精密稱取30g,置于圓燒瓶中,加一定量水,進(jìn)行揮發(fā)油提取,回流提取,收集揮發(fā)油。各次試驗(yàn)中該條件保持不變,按照均勻設(shè)計(jì)安排進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以提取物得率及化合物為評(píng)價(jià)指標(biāo),考察各因素水平對(duì)揮發(fā)油提取效果的影響,得出最佳工藝條件。2.2提取工藝的篩選通過預(yù)試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)對(duì)揮發(fā)油提取物得率影響最大的因素有提取時(shí)間、浸泡時(shí)間、溶劑量、粉碎度。我們選用均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)表U9(94)進(jìn)行最佳提取工藝的篩選。因素水平見表1,實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見表2。2.3最佳提取配方的確定將表2得到的結(jié)果利用均勻設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)處理軟件(DPS9.50標(biāo)準(zhǔn)版)進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)回歸分析,回歸數(shù)學(xué)模型為:Y=1.728199166+0.00488014037X1-0.002131491767X2-0.01317750094X3-0.00561107111X4。顯著水平P值=0.1581;F值=2.9737;相關(guān)系數(shù)R=0.865068;決定系數(shù)R2=0.7483;剩余標(biāo)準(zhǔn)差SSE=0.50359223;調(diào)整后的相關(guān)系數(shù)Ra=0.704759。根據(jù)回歸方程,求出最佳組合見表3?；貧w系數(shù)T檢驗(yàn)的結(jié)果見表4。被引入的有4個(gè)回歸項(xiàng),即X1、X2、X3、X4,其中X1差異顯著,說明提取時(shí)間對(duì)揮發(fā)油提取率影響較大。由回歸方程因素的系數(shù)可見提取時(shí)間對(duì)砂仁揮發(fā)油成分的提取率的影響為正效應(yīng)。由最優(yōu)方案可知:提取時(shí)間為最大值(X1=449.4min),水量、浸泡時(shí)間和藥材目數(shù)取最小值(X2=181.9ml,X3=20.34min,X4=1.029目),說明盡可能加長提取時(shí)間可使砂仁揮發(fā)油提取率升高。2.4干預(yù)砂巖的gc-ms分析2.4.1%苯甲基硅氧烷的制備氣相色譜條件:色譜柱:Cpsil5CB(Varian)30m×0.25nm×0.25m(100%苯甲基硅氧烷);載氣為氦氣;流量為1.0ml/min;柱程序升溫:起始溫度60℃保持6min,以2℃/min速度升至130℃,以5℃/min速度升至175℃,保持2min;進(jìn)樣方式:不分流;進(jìn)樣量:1μl(無水乙醚溶液);進(jìn)樣口溫度:250℃。2.4.2gc/ms檢測離子源為EI;電離電壓:70eV;電子倍培電壓:1929mV;質(zhì)譜Temp:168℃;Vacuum:65mTorr;溶劑延時(shí):5min;質(zhì)譜掃描范圍:50～550amu;掃描質(zhì)量范圍:50～550m/z;樣品經(jīng)峰純度檢測;Wiley138譜庫檢索。2.4.3峰面積歸一化法確定各組分在揮發(fā)油中的相對(duì)含量按照上述的GC-MS條件對(duì)砂仁揮發(fā)油進(jìn)行分析,得到總離子流圖,每個(gè)組分的質(zhì)譜圖經(jīng)計(jì)算機(jī)質(zhì)譜庫檢索及人工解析并與標(biāo)準(zhǔn)譜圖核對(duì),共分離出43個(gè)可識(shí)別峰,鑒定42個(gè)成分,主要成分為乙酸龍腦酯、樟腦、檸檬烯、合成右旋龍腦、莰烯、龍腦,用峰面積歸一化法確定各組分在揮發(fā)油中的相對(duì)含量。結(jié)果見表5。2.4.4揮發(fā)油提取工藝的響應(yīng)面分析一項(xiàng)試驗(yàn),常常需要2個(gè)或更多的指標(biāo)來衡量其效果。在多指標(biāo)試驗(yàn)中,各試驗(yàn)因素及其水平對(duì)各試驗(yàn)指標(biāo)的影響往往是不同的,在眾多的指標(biāo)中,有的指標(biāo)要求越大越好,有的要求越小越好,有的則要求靠近某目標(biāo)值為好。因此,分析多指標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果時(shí)必須統(tǒng)籌兼顧,尋找使各指標(biāo)都盡可能好的條件。本次試驗(yàn)采用均勻試驗(yàn),需要考察的指標(biāo)不止一個(gè),同一因素水平對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)的影響各不相同,故對(duì)試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)的分析應(yīng)從各方面考慮,兼顧得失,綜合決定因素主次及最優(yōu)水平組合。常用的對(duì)多指標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)的分析有“綜合評(píng)分法”和“綜合平衡法”,但在綜合平衡時(shí)往往較為困難,也無法解決復(fù)雜的多指標(biāo)問題。綜合評(píng)分法只要給出評(píng)分方法,一般情況下分析計(jì)算較為方便。本試驗(yàn)采用“綜合評(píng)分法”。綜合評(píng)分法是一種將多指標(biāo)按著一定的規(guī)則轉(zhuǎn)換為單指標(biāo)的方法。具體來講,它是綜合比較各種指標(biāo)的重要性及其實(shí)測值,對(duì)每號(hào)試驗(yàn)結(jié)果評(píng)定出一個(gè)綜合分?jǐn)?shù),而以此分?jǐn)?shù)作為單指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本試驗(yàn)利用一個(gè)包含有各項(xiàng)指標(biāo)加權(quán)系數(shù)(權(quán)值)的公式計(jì)算每號(hào)試驗(yàn)結(jié)果的綜合評(píng)分。加權(quán)系數(shù)的大小由指標(biāo)的重要程度來決定,指標(biāo)越重要加權(quán)系數(shù)越大。這種方法對(duì)指標(biāo)乘以相應(yīng)的加權(quán)系數(shù)得該項(xiàng)指標(biāo)的加權(quán)評(píng)分,再把每號(hào)試驗(yàn)的所有指標(biāo)的加權(quán)評(píng)分相加即得綜合評(píng)分。在本實(shí)驗(yàn)中,參閱相關(guān)文獻(xiàn)可以發(fā)現(xiàn)本次實(shí)驗(yàn)分離鑒定出的砂仁揮發(fā)油化學(xué)成分中為主要有效成分并峰面積較大的成分有乙酸龍腦酯(給予加權(quán)系數(shù)550)、樟腦(給予加權(quán)系數(shù)235)、檸檬烯(給予加權(quán)系數(shù)40)、合成右旋龍腦(給予加權(quán)系數(shù)33)、莰烯(給予加權(quán)系數(shù)16)、龍腦(給予加權(quán)系數(shù)15),其它化學(xué)成分按照酌情給予適合加權(quán)系數(shù),各指標(biāo)加權(quán)系數(shù)見表5,綜合評(píng)分見表6。將表6得到的結(jié)果利用均勻設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)處理軟件(DPS9.50標(biāo)準(zhǔn)版)進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)回歸分析,得到回歸方程:Y=41010.97338+26.17465796X1-34.0956452X2-63.3920656X3-31.25552784X4。顯著水平p值=0.1119;F值=3.8047;相關(guān)系數(shù)R=0.889871;決定系數(shù)R2=0.7919;剩余標(biāo)準(zhǔn)差SSE=2520.14760473;調(diào)整后的相關(guān)系數(shù)Ra=0.764030。根據(jù)回歸方程,求出最佳組合見表7。回歸系數(shù)t檢驗(yàn)的結(jié)果見表8。被引入的有4個(gè)回歸項(xiàng),即X1,X2,X3,X4,其中,X1差異顯著,說明提取時(shí)間對(duì)揮發(fā)油化學(xué)成分影響較大。由回歸方程因素的系數(shù)可見提取時(shí)間對(duì)砂仁揮發(fā)油成分的提取率的影響為正效應(yīng)。由最優(yōu)方案可知:提取時(shí)間為最大值(X1=444.7646min),水量、浸泡時(shí)間和藥材目數(shù)取最小值(X2=190.6447ml,X3=21.22min,X4=1.0142目),說明盡可能加長提取時(shí)間可使砂仁揮發(fā)油提取率升高。2.4.5揮發(fā)油成分有以下幾種我們由9個(gè)砂仁樣品揮發(fā)油特征圖譜及表5發(fā)現(xiàn),在不同的提取條件下,水蒸氣提取砂仁揮發(fā)油得出的揮發(fā)油成分有較大差異,在圖譜上可以見到特征峰在30min之前是基本一致的,在30min之后,特征峰的數(shù)量和位置是不同的。9個(gè)樣品共檢出42個(gè)成分,主要共同的成分有2-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、月桂烯、檸檬烯、松油烯、芳樟醇、樟腦、龍腦、異龍腦、乙酸龍腦酯,因提取條件的不同,有些成分出現(xiàn)在個(gè)別的樣品中,如表5;根據(jù)42個(gè)化學(xué)成分的性質(zhì),按照其結(jié)構(gòu)分為無環(huán)單萜、單環(huán)單萜、雙環(huán)單萜、無環(huán)倍半萜、單環(huán)倍半萜、雙環(huán)倍半萜和三環(huán)倍半萜,如表9所示。樣品1中揮發(fā)油成分大致為單萜類化合物,因?yàn)樘崛r(shí)間少,相對(duì)分子量較大的倍半萜類化合物還沒有提取出來,所以本樣品中以單萜類化合物為主,其主要成分為乙酸龍腦酯(52.02%)、樟腦(35.589%)、合成右旋龍腦(6.774%)、檸檬烯(1.757%)等。樣品2中揮發(fā)油成分以單萜類化合物為主,比樣品1中的成分多,其原因?yàn)榻輹r(shí)間長,使砂仁有更多的時(shí)間與水接觸,得出的成分較多。主要成分為乙酸龍腦酯(36.268%)、樟腦(40.283%)、龍腦(6.528%)、檸檬烯(3.217%)、莰烯(3.123%)等。樣品3中揮發(fā)油成分為單萜和倍半萜,尤其以單萜為主,原因?yàn)樯叭蕿閾v碎顆粒,有充足的表面積與水接觸,且提取時(shí)間加長至180min,有利于揮發(fā)油的蒸出。主要成分為乙酸龍腦酯(44.636%)、樟腦(17.676%)、龍腦(3.925%)、а-姜黃烯(3.76%)、榧烯醇(3.749)等。樣品4中揮發(fā)油成分增多,還有一些烷烴,與樣品3的差別在于藥材浸泡時(shí)間和藥材粒度。主要成分為乙酸龍腦酯(51.162%)、樟腦(21.629%)、檸檬烯(4.012%)、合成右旋龍腦(3.648%)、莰烯(3.089%)、橙花叔醇(3.246%)等。樣品5中揮發(fā)油成分為單萜和倍半萜,單萜為主,原因?yàn)樘崛r(shí)間有300min,使砂仁內(nèi)的揮發(fā)油隨水蒸氣餾出時(shí)間加長,其成分中相對(duì)分子量高的倍半萜成分餾出增多。主要成分為乙酸龍腦酯(60.718%)、樟腦(20.377%)、檸檬烯(4.428%)、合成右旋龍腦(3.937%)等。樣品6中的成分以單萜為主,還有一些烷烴,無倍半萜成分餾出。主要成分為乙酸龍腦酯(57.907%)、樟腦(21.554%)、檸檬烯(6.013%)、合成右旋龍腦(3.629%)、莰烯(3.066%)等。樣品7中的成分以單萜為主,次之為倍半萜,與樣品6相比,為藥材粒度的不同,使得本樣品中含有倍半萜。主要成分為乙酸龍腦酯(64.789%)、樟腦(15.58%)、合成右旋龍腦(3.782%)、檸檬烯(3.722%)等。樣品8中的成分以單萜為主,倍半萜次之,因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)的提取時(shí)間、水量、浸泡時(shí)間比其它樣品實(shí)驗(yàn)多,使提取的化學(xué)成分較多。主要成分為乙酸龍腦酯(61.362%)、樟腦(18.762%)、檸檬烯(5.126%)、合成右旋龍腦(3.783%)等。樣品9中的成分為單萜和倍半萜,本實(shí)驗(yàn)的提取條件為9個(gè)樣品之最,得出的成分最多。主要成分為乙酸龍腦酯(52.453%)、樟腦(12.943%)、檸檬烯(3.753%)等。3最佳提取工藝的確定均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)的基本思想是拋開正交設(shè)計(jì)中“整齊可比”的特點(diǎn)而只考慮實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的“均勻分散”性,即讓試驗(yàn)點(diǎn)在所考察的范圍內(nèi)盡量均勻地分布。由于不考慮“整齊可比”性,在正交試驗(yàn)中為整齊可比而設(shè)置的試驗(yàn)點(diǎn)可不再考慮,因而可大大減少試驗(yàn)次數(shù),且試驗(yàn)次數(shù)與各因素所取的水平數(shù)相等。均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)是一種較好的試驗(yàn)條件優(yōu)化方法。只要我們正確運(yùn)用均勻設(shè)計(jì),這種方法不僅可以減少試驗(yàn)次數(shù)、提高效率,而且可以節(jié)約時(shí)間和經(jīng)費(fèi)。本試驗(yàn)是采用多指標(biāo)均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)選砂仁揮發(fā)油的水蒸氣提取工藝,以提取時(shí)間、水量、浸泡時(shí)間和藥材粒度作為四個(gè)因素設(shè)計(jì)均勻?qū)嶒?yàn)。試驗(yàn)得出的數(shù)據(jù)在DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中作回歸處理分析,從而分析出最佳的提取工藝。在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)影響砂仁揮發(fā)油提取率的因素:①砂仁的粒度,砂仁不是粉碎越小越好,而是在一定的粒度下,才能提取出最多的油量,因?yàn)榉勰?huì)吸附揮發(fā)油,使油不能隨水蒸氣蒸出;②提取時(shí)間,提取時(shí)間過短則不能有效地提取出砂仁中的揮發(fā)油成分,時(shí)間過長則可能會(huì)導(dǎo)致?lián)]發(fā)油的流失;③圓底燒瓶的容積,圓底燒瓶的容積與水量有關(guān),圓底燒瓶中的水一定不能超過燒瓶容積的2/3,若超過了,會(huì)容易引起爆沸現(xiàn)象,使燒瓶中的砂仁隨水流入收集揮發(fā)油的裝置中。在本試驗(yàn)中砂仁揮發(fā)油提取率為指標(biāo)的均勻分析顯示,最佳條件為:提取時(shí)間450min,水量182ml,浸泡時(shí)間21min,藥材目數(shù)1。砂仁揮發(fā)油化學(xué)成分的多指標(biāo)均勻分析顯示,最佳