PCR原理及其操作

PCR反應(yīng)原理及其操作生物化工韓棟1.PCR的基本原理2.PCR反應(yīng)體系3.PCR的基本步驟

4.PCR反應(yīng)五要素

5.PCR

的反應(yīng)流程PCR的基本原理

試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，依據(jù)DNA半保留復(fù)制的機(jī)理；體外DNA分子于不同溫度下可變性和復(fù)性的性質(zhì)；通過人為控制體外合成系統(tǒng)的溫度，使雙鏈DNA變成單鏈，單鏈DNA與人工合成的引物退火，DNA聚合酶使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈DNA。PCR反應(yīng)體系4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+

1.5mmol/LPCR的基本步驟

72℃94℃55℃PCR循環(huán)PCR的基本步驟1.變性：高溫使雙鏈DNA解離形成單鏈（94℃，30s）。2.退火：低溫下，引物與模板DNA互補(bǔ)區(qū)結(jié)合（55℃，30s）。3.延伸：中溫延伸。DNA聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的DNA鏈延伸反應(yīng)（70～72℃，30～60s）PCR的基本步驟1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）低溫退火2高溫變性1適溫延伸3重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA變性形成2條單鏈DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍高溫變性低溫退火中溫延伸PCR每一步的轉(zhuǎn)換通過溫度的改變控制。DNA模板解鏈（變性）、引物與模板結(jié)合（退火）、DNA聚合酶催化新生DNA的合成（延伸）三個(gè)步驟構(gòu)成PCR反應(yīng)的一個(gè)循環(huán)。此循環(huán)反復(fù)進(jìn)行，可使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。理論擴(kuò)增率：2n遞增（n為循環(huán)次數(shù)），25～30循環(huán)，目標(biāo)DNA可增加109倍。實(shí)際擴(kuò)增率：(１＋Ｘ)n，X為PCR的實(shí)際擴(kuò)增率，平均約為75%。由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，逐漸由指數(shù)形式變?yōu)榫€性形式，所以實(shí)際上進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，擴(kuò)增倍數(shù)一般可達(dá)106～107。以上“變性、退火、延伸”三部曲為PCR一輪循環(huán)。PCR擴(kuò)增曲線

PCR反應(yīng)五要素

1.引物（primer）2.酶（TaqDNApolymerase）

3.dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）

4.模板（template）5.Mg2+（magnesium）1.引物

引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)的原則

①引物長(zhǎng)度：

15-30bp，常用為20bp左右；②引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb；③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列；④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)：避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3’端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶；⑤引物3’端的堿基應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)：特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失??；⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處；⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無明顯同源性；⑧引物量：每條引物的濃度0.1~0.5μM，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好—引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)2.酶及其濃度

目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)：