ywt流式細(xì)胞儀的構(gòu)造、工作原理及數(shù)據(jù)分析

流式細(xì)胞儀的構(gòu)造、工作原理及數(shù)據(jù)分析濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)附屬醫(yī)院衣文婷流式細(xì)胞術(shù)（flowcytometery,FCM）是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的一種可以快速、準(zhǔn)確、客觀，可同時(shí)檢測(cè)單個(gè)微粒（通常是細(xì)胞）的多項(xiàng)特性，并加以定量的技術(shù)，并且可以對(duì)特定群體加以分選。研究對(duì)象為生物顆粒，如各種細(xì)胞、微生物及人工合成微球等研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征，并加以定量。流式細(xì)胞儀是一種集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測(cè)量技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)以及細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)為一體的新型高科技儀器。流式細(xì)胞儀的分類分析型流式細(xì)胞儀細(xì)胞樣本分析后最終進(jìn)入廢液桶，不能回收利用。分選型流式細(xì)胞儀既能流式分析，還能對(duì)分析的目的細(xì)胞進(jìn)行分選；進(jìn)樣管道較長(zhǎng)，還需要保持無(wú)菌狀態(tài)，所以分選型流式細(xì)胞儀一般只用于分選。BD公司分選型流式細(xì)胞儀FACSVantageSEFACSAriaIIIInfluxBeckmanCoulter流式細(xì)胞儀EpicsXL單激光四色，市場(chǎng)覆蓋率高，分析型CyAn三激光九色，分析型FC500單激光或雙激光五色，市場(chǎng)覆蓋率高，分析型Gallios三激光十色，分析型MoFloXDP高端分選型流式細(xì)胞儀的特點(diǎn)單個(gè)細(xì)胞或微粒分析同時(shí)多參數(shù)分析速度快：10000個(gè)細(xì)胞(微粒)/秒統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：提供細(xì)胞群體的均值和分布情況分選感興趣的細(xì)胞或微粒其結(jié)構(gòu)一般分為5部分：流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)；激光光源及光束形成系統(tǒng)；光學(xué)系統(tǒng)；信號(hào)檢測(cè)、存儲(chǔ)、顯示分析系統(tǒng)；細(xì)胞分選系統(tǒng)。（一）流動(dòng)室與液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)

流動(dòng)室內(nèi)充滿了鞘液，鞘液的作用是將樣品流環(huán)包，鞘液流是一種穩(wěn)定的液體流動(dòng)，鞘液以勻速運(yùn)動(dòng)流過(guò)流動(dòng)室，在整個(gè)系統(tǒng)運(yùn)行中流速是不變的，樣品流在鞘液的環(huán)包下形成流體力學(xué)聚焦，使樣品流不會(huì)脫離液流的軸線方向，并且保證每個(gè)細(xì)胞通過(guò)激光照射區(qū)的時(shí)間相等，從而得到準(zhǔn)確的細(xì)胞熒光信息。在管道大約50倍直徑距離處，鞘液中心速度與邊緣速度達(dá)到穩(wěn)定，形成穩(wěn)定的層流。樣本與鞘液未入管道時(shí)，邊緣與中心速度一致。進(jìn)入管道后，受管壁粘性阻力邊緣速度下降，中心速度不變。流體形成層流后，會(huì)產(chǎn)生流體聚焦效應(yīng)，所有顆粒均被推致流速最快的液流中。顆粒以衡定的速度作勻速運(yùn)動(dòng)。

液流系統(tǒng)鞘流技術(shù)：根據(jù)層流原理發(fā)展起來(lái)的技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)兩種液體的同軸流動(dòng)，樣本細(xì)胞流位于軸心穩(wěn)定流動(dòng)，外面包裹有鞘液(sheath)。流體動(dòng)力學(xué)聚焦：穩(wěn)定的液流從截面積較大的部分流入截面積較小的部分后，有一個(gè)聚焦收縮作用，細(xì)胞流直徑被約束在10-20um，避免了多個(gè)細(xì)胞重疊進(jìn)入檢測(cè)區(qū)。鞘液鞘液細(xì)胞流激光照射點(diǎn)流體動(dòng)力學(xué)聚焦示意圖（一）流動(dòng)室和液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)流動(dòng)室(flowcell,flowchamber)是流式細(xì)胞儀的核心部件。流動(dòng)室中，被測(cè)細(xì)胞逐個(gè)通過(guò)，并在此與激光正交。進(jìn)樣孔熒光信號(hào)激光束鞘液Sheath流動(dòng)室結(jié)構(gòu)圖：?jiǎn)渭?xì)胞發(fā)生器液流系統(tǒng)：鞘液系統(tǒng)＋樣品流動(dòng)系統(tǒng)-15-液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)(二)光學(xué)系統(tǒng)激光熒光進(jìn)樣孔熒光信號(hào)激光束鞘液Sheath

與標(biāo)記熒光素?zé)o關(guān)，

是細(xì)胞的固有參數(shù)。反應(yīng)細(xì)胞的大小和顆粒（二）流式細(xì)胞儀可檢測(cè)的細(xì)胞的參數(shù)：

散射光信號(hào)前向角散射光（FSC,ForwardScatter）

入射光的前向

(5)散射光信號(hào),

側(cè)向角散射光（SSC,SideScatter）

入射光90

角的散射光信號(hào)，

散射光信號(hào)前向角散射光－FSC可反映：細(xì)胞相對(duì)大小及其表面積FALSSensorLaser散射光信號(hào)側(cè)向角散射光－SSC可反映：細(xì)胞顆粒性程度FALSSensor90LSSensorLaser流式細(xì)胞的基本信息:“形態(tài)”外周全血細(xì)胞（紅細(xì)胞溶解后）

以散射光表示的雙參數(shù)點(diǎn)圖-26-（三）散射光的作用實(shí)驗(yàn)中，常利用FSC和SSC這兩種參數(shù)的組合，區(qū)分不同的細(xì)胞群體，去除碎片、死細(xì)胞和粘連細(xì)胞的干擾。粒細(xì)胞單核細(xì)胞淋巴細(xì)胞紅細(xì)胞、死細(xì)胞和碎片（二）流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞參數(shù):

特征信息－熒光（Fluorescence）信號(hào)熒光素吸收激光（激發(fā)光波長(zhǎng)）能量熒光素將吸收能量釋放，轉(zhuǎn)換為釋放較入射光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光量子（發(fā)射光波長(zhǎng)）熒光素與特異抗體結(jié)合（熒光抗體）熒光抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合越多，產(chǎn)生熒光信號(hào)越強(qiáng) 熒光素與細(xì)胞核酸結(jié)合，熒光強(qiáng)度反映核酸含量-28-FCM可檢測(cè)下列細(xì)胞成分：表面標(biāo)記物胞漿標(biāo)記物核內(nèi)標(biāo)記物可溶性成分黏附因子表面受體細(xì)胞因子分泌到胞外的細(xì)胞因子胞內(nèi)抗原核酸含量核內(nèi)抗原一般檢測(cè)時(shí)，獲取1～2萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，標(biāo)記0.5～1×106細(xì)胞即可。下述情況細(xì)胞量需相應(yīng)增加：檢測(cè)胞內(nèi)/核內(nèi)抗原，離心次數(shù)多；細(xì)胞周期乙醇固定損失細(xì)胞多；檢測(cè)細(xì)胞在標(biāo)本中比例低···0.5～1×106個(gè)細(xì)胞孵育體積50-100ul上機(jī)體積200-500ul終濃度約1×106個(gè)/ml加染料洗滌后補(bǔ)加液體細(xì)胞表面抗原標(biāo)記表面抗原分析是流式應(yīng)用中最廣泛的，標(biāo)記步驟也相對(duì)簡(jiǎn)單。標(biāo)記：取0.5～1×106細(xì)胞，加入適量抗體(根據(jù)抗體說(shuō)明書)，充分混勻后(總體積50-100ul)，4℃避光孵育