高效液相色譜法測(cè)定頭孢地尼及制劑中聚合物的含量

高效液相色譜法測(cè)定頭孢地尼及制劑中聚合物的含量目的采用聚苯乙烯高效液相色譜法檢查頭孢地尼中聚合物的方法。方法色譜柱為聚苯乙烯凝膠為填料的TSKgelG2000SWxl（7.8mm×300mm5um）色譜柱，流動(dòng)相為0.1mol/L，pH=7.0緩沖溶液-甲醇（95∶5），流速為0.5mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)285nm，通過(guò)HPLC-ESI-MS法鑒定高分子雜質(zhì)峰，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行推定。結(jié)果頭孢地尼在0.0002～1.5mg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系（r=1.0000）最小檢測(cè)濃度為0.2ug/mL，聚合物雜質(zhì)與頭孢地尼能有效分離，并先于主峰流出，方法專屬性良好，樣品在溶液中不穩(wěn)定，需臨用新配。結(jié)論建立的方法快速準(zhǔn)確。適用于頭孢地尼及其聚合物的測(cè)定。標(biāo)簽：高效液相色譜；聚苯乙烯凝膠；頭孢地尼；聚合物；β-內(nèi)酰胺類抗生素；過(guò)敏原頭孢地尼為半合成的第三代口服頭孢菌素，屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素，具有抗菌譜廣、療效高、毒性低等特點(diǎn)。β-內(nèi)酰胺抗生素是目前臨床上最常用的抗感染藥物[1]。研究證明，引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的過(guò)敏原不是抗生素本身，而是其中的高分子雜質(zhì)，因此國(guó)內(nèi)外對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的高分子雜質(zhì)的控制非常重視。2010版中國(guó)藥典已有22個(gè)品種43個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的控制[2]。中國(guó)藥典2010年版已采用葡聚糖G-10自身對(duì)照外標(biāo)法對(duì)大部份常用注射用頭孢類抗生素進(jìn)行了高分子雜質(zhì)控制，也有文獻(xiàn)報(bào)道使用葡聚糖G-10用于頭孢地尼聚合物的測(cè)量[3]。葡聚糖G-10可以手工填裝，也有商品化色譜柱，使用該填料的分離的色譜峰拖尾嚴(yán)重，不利于該產(chǎn)品聚合物的測(cè)定。日本藥典（JP）對(duì)頭孢卡品酯采用以苯乙烯-二乙烯基苯共聚物為基礎(chǔ)的TSKgelG2000色譜柱進(jìn)行聚合物控制。也有文獻(xiàn)報(bào)道使用國(guó)產(chǎn)的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物為基礎(chǔ)的，以分子排阻為主要分離機(jī)制，用于測(cè)定頭孢呋辛酯中高分子聚合物的檢查[4]。因此我們采用苯乙烯為填料的TSKgelG2000SWxl色譜柱。1儀器與試藥液相色譜儀，檢測(cè)器：Waters2998，溶液輸送泵：Waters2695，柱溫箱：WatersCorporation工作站：Empower版本6.20。2色譜條件色譜柱，TOSOHTSKgelG2000SWxl（300mm）；柱溫：35℃恒溫。流速：0.5mL/min。3溶液的制備3.1對(duì)照品溶液的制備取頭孢地尼對(duì)照品適量，精密稱定，用0.1mol/LpH=7.0緩沖液制成含頭孢地尼對(duì)0.01mg/mL的溶液。3.2供試品溶液的制備取樣約品10mg，精密稱定，置10mL量瓶中，加0.1mol/LpH=7.0緩沖液稀釋至刻度搖勻。4色譜條件的選擇與優(yōu)化4.1流動(dòng)相組成的選擇去頭孢地尼對(duì)照品適量，精密稱定，用pH=7.0緩沖溶液稀釋成1mg/mL的溶液，在25℃放置48h，精密量取10μL，分別用表1中的四種流動(dòng)相進(jìn)行分析，色譜圖如圖所示，用頭孢地尼主成分與其檢出雜質(zhì)、分離度、峰面積及總分析時(shí)間為分析指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)上述五種色譜系統(tǒng)中，0.1mol/LpH=7.0緩沖溶液-甲醇（95∶5），作為流動(dòng)相時(shí)，各項(xiàng)指標(biāo)最優(yōu)，故選用0.1mol/LpH=7.0緩沖溶液-甲醇（95∶5）作為流動(dòng)相，見圖1。4.2流速的影響在0.1mol/LpH=7.0緩沖溶液-甲醇（95∶5）色譜系統(tǒng)中，考察選流速對(duì)色譜分離的影響，結(jié)果顯示流速為1.0ml/min時(shí)，雜質(zhì)峰與主成分峰不能有效分離，當(dāng)流速降為0.5mL/min時(shí)，各峰的分離度良好，雜質(zhì)峰的保留時(shí)間為22.067min主峰流出在25.010min之后，在30min內(nèi)，完成一個(gè)樣品分析，典型的色譜圖，見圖2。4.3柱溫的影響取供試品溶液按2.1項(xiàng)下的方法，分別在25℃、35℃、50℃下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果在35℃時(shí)主成分與雜質(zhì)鋒的分離效果和對(duì)稱性最優(yōu)。5專屬性考察5.1聚合物的結(jié)構(gòu)鑒定采用LC-ESI-MS法，測(cè)定系統(tǒng)適用性考察用溶液中高分子聚合物的分子量，通過(guò)對(duì)待測(cè)樣品LC分析，樣品中有少量雜質(zhì)峰，根據(jù)相關(guān)文件報(bào)道，猜測(cè)其是頭孢地尼的低聚物。對(duì)強(qiáng)度較大的813.0，791.0，828.9峰分析，它們分別對(duì)應(yīng)與二聚加鈉峰，二聚加鉀峰，見圖3。5.2強(qiáng)力破壞樣品中聚合物的分離取本品原料適量，分別經(jīng)強(qiáng)酸（0.1mol/LHCl）沸水浴，強(qiáng)堿（0.1mol/LNaOH）沸水浴，過(guò)氧化氫沸水浴，加熱破壞處理，光照，綜合后分別用流動(dòng)相稀釋成0.2mg/mL的供試品溶液。取10uL按上述色譜條件進(jìn)行分離。結(jié)果表明，在上述色譜系統(tǒng)下，各種破壞試驗(yàn)均能使聚合物峰增大，以堿破壞和氧化破壞最為明顯，各峰分離度良好。溶劑不干擾頭孢地尼及其高分子雜質(zhì)的測(cè)定。表明該方法的專屬性良好。5.3輔料的干擾取空白輔料，按片劑的配方除主成分外的混合輔料，按3.1供試液制備的方法配制空白輔料溶液，搖勻，取續(xù)濾液。立即精密量取10uL，按照樣品測(cè)定方法測(cè)定，結(jié)果表明，在該色譜條件下輔料在286nm檢測(cè)波長(zhǎng)下均不出峰，對(duì)高分子雜質(zhì)的色譜行為不產(chǎn)生干擾。5.4線性與范圍精密稱取頭孢地尼對(duì)照品適量，用0.1mol/LpH=7.0緩沖液稀釋制成每1mL中含頭孢地尼分別為0.0005、0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1和1.5mg的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣10uL，用2.1的色譜條件測(cè)定。以頭孢地尼的峰面積（A）對(duì)其濃度（C）進(jìn)行線性回歸，得線性方程A=65099678.3C-109555.5結(jié)果表明，頭孢地尼在0.0002～1.5mg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系r=1.0000。5.5精密度取連續(xù)進(jìn)樣6次，1mg/mL的對(duì)照品溶液，測(cè)峰面積，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差RSD為0.32%，表明方法精密度良好。5.6最低檢測(cè)限精密量取頭孢地尼對(duì)照品適量用0.1mol/LpH=7.0緩沖液溶解，逐級(jí)稀釋后進(jìn)樣10uL，按S/N=3作為檢測(cè)限，記錄色譜圖，最低檢測(cè)濃度約為0.2ug/mL，靈敏度良好。5.7供試品濃度與聚合物測(cè)定結(jié)果性關(guān)系考察按3.1配制供試品溶液分別用0.1mol/LpH=7.0緩沖液稀釋制成0.01、0.02.、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5mg的溶液，搖勻，精密量取10uL按樣品測(cè)定方法測(cè)定，結(jié)果表明在0.01～1.5mg/mL濃度范圍內(nèi)，聚合物峰面積與頭孢地尼主峰相關(guān)性良好，相關(guān)系數(shù)為r=1.0000。5.8樣品測(cè)定精密稱取頭孢地尼片樣品粉末適量，用0.1mol/LpH=7.0緩沖液稀釋并制成約含1mg/mL的溶液。按文中所提的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，3批樣品測(cè)定結(jié)果，見表2。6討論以苯乙烯-二乙烯基苯共聚物為基礎(chǔ)的TSKgelG2000該色譜柱以分子量排阻為主要分離機(jī)制，有別于其他聚合物基質(zhì)的色譜填料，具有耐高壓，耐酸堿的特點(diǎn)，對(duì)水溶性和有機(jī)溶劑流動(dòng)相均適用。今后可以適用于其他β-內(nèi)酰胺類抗生素中聚合物的測(cè)定。在PDA全波長(zhǎng)掃描下，檢測(cè)系統(tǒng)適用性溶液，所得雜質(zhì)及主成分的最大吸收在285nm，主成分峰的最大吸收為285nm，故選擇285nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。較之普通聚合物采用單一檢測(cè)波長(zhǎng)254nm更具有合理性參考文獻(xiàn)：[1]金少鴻，胡昌勤，仇士林，等.β-內(nèi)酰胺類抗生素過(guò)敏反應(yīng)的研究[J].醫(yī)學(xué)研究通訊，2002，31（4）：22-23.[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典，2010二部