生理ph值條件下農(nóng)藥吡蟲啉與牛血紅蛋白相互作用的研究

生理ph值條件下農(nóng)藥吡蟲啉與牛血紅蛋白相互作用的研究

血液是動物和人類器官執(zhí)行氧氣任務的蛋白質(zhì)，也是生命身體開展各種生理活動的主要承擔者。1個Hb分子由1個珠蛋白和4個血紅素構(gòu)成,相對分子質(zhì)量約為64500,分子中含有4個亞基,分別和4個血紅素結(jié)合。血紅蛋白分子中每條α鏈和β鏈含有的色氨酸(Trp)殘基分別為α-14Trp、β-15Trp、β-37Trp。Rodgers等認為位于疏水腔內(nèi)的β-37Trp是血紅蛋白內(nèi)源熒光的主要來源,同時β-37Trp熒光的變化與血紅蛋白R-T構(gòu)象的轉(zhuǎn)變及血紅蛋白的載氧功能有著密切的聯(lián)系。對于蛋白質(zhì)與內(nèi)源性化合物及許多藥物分子之間相互作用的研究一直受到人們關(guān)注,而關(guān)于農(nóng)藥分子與蛋白質(zhì)作用的光譜研究的報道相對較少。吡蟲啉(1-(6-氯-3-吡啶甲基)-N-硝基咪唑烷-2-基胺)是一種氯代煙堿類殺蟲劑,是煙酸乙酰膽堿酯酶(nAChR)受體的作用體,神經(jīng)毒理效應很強。吡蟲啉廣泛應用于棉花、水稻等農(nóng)作物,對家蠶和蝦類屬高毒農(nóng)藥,對蜜蜂的毒性極高。隨著吡蟲啉農(nóng)藥的長期和大量使用,勢必會影響人體的健康,對于吡蟲啉的急、慢性中毒的救治,至今沒有特異性的藥物可以應用。本文以相關(guān)研究報道相對較少的血紅蛋白作為血液中生物大分子的代表,在模擬動物體生理pH值條件下,運用紫外可見光譜(UV/Vis)、熒光光譜(FS)研究吡蟲啉與牛血紅蛋白(BHb)的相互作用,計算了農(nóng)藥分子與BHb結(jié)合時的表觀結(jié)合常數(shù)KA、結(jié)合位點數(shù)n和結(jié)合反應的熱力學參數(shù),利用同步熒光技術(shù)探討了農(nóng)藥吡蟲啉與BHb的作用特點,為研究吡蟲啉農(nóng)藥與蛋白質(zhì)的結(jié)合方式、明確吡蟲啉對血紅蛋白的性能的影響提供了一些基礎(chǔ)信息,對研究農(nóng)藥的環(huán)境影響也具有一定的意義。1實驗部分1.1新型親水性液的制備帶恒溫系統(tǒng)的LS-50B型熒光光度計(美國Perkin-Elmer公司);GBCUV/Vis916紫外-可見光譜儀(澳大利亞);PHS-3C型精密pH計(上海雷磁儀器廠);ZC-18Q智能型超級恒溫水槽(寧波天恒儀器廠);高純水制備儀(日本Millipore公司)。吡蟲啉(鹽城利民化工廠提供,純度大于95%)配制成1.0mmol·L-1的儲備液,保存于4℃的冰箱中備用;牛血紅蛋白(購于Sigma公司)用pH7.4的三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖溶液(內(nèi)含0.15mol·L-1NaCl維持離子強度)配制成5.0μmol·L-1儲備溶液并于冰箱中(溫度低于5℃)保存。除Tris為生化試劑外,其余試劑均為分析純試劑,實驗用水為高純水(電阻率為18.2MΩ·cm)。1.2熒光掃描和同步熒光光譜移取2.5mL5.0μmol·L-1BHb于1cm的石英比色皿中,用微量注射器逐次加入1.0mmol·L-1的吡蟲啉溶液進行熒光滴定(滴定劑累加體積小于0.1mL),每次加入溶液后混合均勻,在一定溫度下作用10min后,于280nm激發(fā)波長下進行熒光掃描。光源為脈沖式氙燈,發(fā)射與激發(fā)狹縫寬度均為10nm,掃描速率500nm/min,在LS-50B型熒光分光光度計上記錄290～500nm波長范圍內(nèi)的發(fā)射光譜;固定△λ=15nm或△λ=60nm,記錄吡蟲啉與BHb作用的同步熒光光譜。為扣除吡蟲啉紫外吸收的影響,測定時各以相應的吡蟲啉溶液作為參比,在293K,190～500nm范圍內(nèi),用GBCUV/Vis916紫外-可見光譜儀記錄純BHb溶液、純吡蟲啉溶液和吡蟲啉-BHb混合溶液的紫外可見示差光譜。2結(jié)果與討論2.1吡蟲啉和brb相互作用的穩(wěn)定性圖1為吡蟲啉與BHb的紫外可見示差吸收光譜。當溶液中不含吡蟲啉時(圖1中曲線a),在190～500nm吸收范圍內(nèi)可觀察到208、270和405nm處的3個吸收峰,它們分別是血紅蛋白肽鏈中氨基酸殘基、色氨酸和酪氨酸殘基的芳香雜環(huán)的吸收峰和血紅素的特征峰,這些生色團的吸收光譜受溶液條件的改變而產(chǎn)生變化。吡蟲啉溶液在190～500nm吸收范圍內(nèi)可觀察到208、270nm處的2個吸收峰(圖1中曲線i)。隨著溶液中吡蟲啉與血紅蛋白摩爾比的增加(0∶1～10.4∶1),BHb(5.0μmol·L-1)在208nm處的吸收峰發(fā)生明顯紅移,由208nm移到228nm,吸收峰的強度由3.20降至1.34,這說明吡蟲啉和BHb彼此間發(fā)生了相互作用,生成復合物,導致BHb主鏈構(gòu)象發(fā)生了變化,螺旋結(jié)構(gòu)變得疏松,降低了生色團基態(tài)與激發(fā)態(tài)的能量差,使肽骨架上電子的激發(fā)能降低而引起其吸收峰吸光度的降低和峰位的紅移。BHb分子中血紅素基團被包埋在蛋白鏈中,蛋白鏈上很多氨基酸的疏水性基團位于鏈的內(nèi)側(cè),在血紅素周圍創(chuàng)造了一個疏水性環(huán)境,避免了極性分子或氧化劑進入,從而保護在BHb分子中Fe(Ⅱ)血紅素的穩(wěn)定。405nm處的吸收峰就是血紅素的Soret譜帶特征峰,隨著溶液中吡蟲啉與血紅蛋白摩爾比的增加(0∶1～10.4∶1),它的吸收峰吸光度略有降低,峰位沒有紅移,表明吡蟲啉分子沒有與血紅素輔基發(fā)生直接作用。2.2吡蟲啉對brb熒光創(chuàng)造的影響當BHb在280nm光激發(fā)下,其發(fā)射光譜(見圖2)在290～500nm范圍內(nèi)有兩個發(fā)射峰,340nm為BHb中色氨酸和酪氨酸殘基的熒光發(fā)射峰,452nm的熒光發(fā)射,可能類似原卟啉熒光發(fā)射,反映了卟啉和結(jié)合蛋白質(zhì)分子的某些獨特的相互作用。圖2為固定BHb濃度下體系的熒光發(fā)射光譜隨吡蟲啉濃度的變化譜圖?？梢钥闯?隨著吡蟲啉濃度的增加,兩個熒光發(fā)射波長分別保持在340、452nm左右,同時蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光強度均有規(guī)律地降低,說明兩者之間存在著相互作用,發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移。曾測定了吡蟲啉在290～500nm范圍內(nèi)的紫外吸收光譜(圖1中曲線i),并與BHb的熒光發(fā)射光譜比較,發(fā)現(xiàn)在290～500nm之間兩者有不同程度的重疊,由于BHb的熒光光譜沒有發(fā)生畸變,表明兩者之間的能量轉(zhuǎn)移屬于非輻射能量轉(zhuǎn)移。340nm的熒光峰主要為BHb中β-37Trp的熒光發(fā)射,由于β-37Trp熒光的變化能夠體現(xiàn)血紅蛋白四級空間構(gòu)象的改變,因此吡蟲啉分子對β-37Trp的熒光猝滅表明其可能影響了BHb的載氧功能。此外,405nm附近的紫外吸收光譜表明,吡蟲啉分子不能與血紅素輔基發(fā)生直接作用,但吡蟲啉分子使BHb在452nm的熒光發(fā)射峰強度降低,表明吡蟲啉分子可能干擾了珠蛋白部分與血紅素輔基的相互作用。熒光猝滅過程通?？梢苑譃閯討B(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。動態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間的相互作用引起的,其過程遵循Stern-Volmer方程:I0F/IF=1+KsvcQ=1+Kqτ0cQ(1)式中I0FF0和IF分別表示不加入和加入猝滅劑時體系的相對熒光強度;Ksv為動態(tài)猝滅常數(shù)(即Stern-Volmer猝滅常數(shù));cQ為猝滅劑的濃度;Kq為熒光猝滅速率常數(shù),各類猝滅劑對生物大分子的最大Kq值一般為2.0×1010L·mol-1·s-1;τ0為不存在猝滅劑時熒光物質(zhì)的平均壽命,生物大分子的熒光平均壽命一般約為10-8s。根據(jù)圖2,假設吡蟲啉對BHb的熒光猝滅過程為動態(tài)猝滅,則由式(1)作出熒光發(fā)射峰在340nm處BHb熒光猝滅的Stern-Volmer曲線,如圖3所示:由圖中直線的斜率及截距可求出不同溫度下結(jié)合反應的Ksv(293K:3.277×104L·mol-1;303K:3.135×104L·mol-1)和Kq(293K:3.277×1012L·mol-1;303K:3.135×1012L·mol-1),Kq的數(shù)值在1012數(shù)量級,遠大于動態(tài)猝滅的Kq值2.0×1010L·mol-1·s-1,隨著溫度的升高KSV有所降低,從這種意義上考慮,吡蟲啉對BHb的熒光猝滅作用不是由擴散和碰撞引起的動態(tài)猝滅,而是吡蟲啉與BHb形成了基態(tài)復合物,對BHb內(nèi)源性熒光的猝滅過程應為靜態(tài)猝滅。這與吡蟲啉與BHb的紫外示差吸收光譜表明的結(jié)果相吻合。同時同步熒光光譜(圖4)中蛋白質(zhì)的色氨酸殘基特征熒光峰位置發(fā)生明顯紅移,也是二者發(fā)生反應生成復合物的標志。2.3吡蟲啉與brb的相互作用吡蟲啉對BHb的猝滅機理為靜態(tài)猝滅,二者的結(jié)合符合熒光物質(zhì)-猝滅劑間的結(jié)合表達式:logF-IF)/IF=nlogKA-nlog{1/DT)-(I0F-IF)C(PT)/I0F}(2)式中c(Dt)和c(Pt)分別為溶液中吡蟲啉和BHb的總濃度。由式(2)作lg～log{1/}圖,見圖5,由圖中直線的斜率及截距計算不同溫度下吡蟲啉與BHb表觀結(jié)合常數(shù)KA、結(jié)合位點數(shù)n。表1數(shù)據(jù)表明,吡蟲啉與BHb分子之間具有較強的相互作用,且大約每一個吡蟲啉分子與一個蛋白質(zhì)分子結(jié)合形成絡合物,由于位于疏水腔內(nèi)的β-37Trp是血紅蛋白內(nèi)源熒光的主要來源,因此吡蟲啉分子與BHb的作用位點更接近于β-37Trp。當溫度變化不大時,結(jié)合反應的焓變△H可看成1個常數(shù),根據(jù)下列熱力學公式可以求得結(jié)合反應的標準吉布斯自由能變ΔGθ、焓變ΔHθ、熵變ΔSθ(見表1)。根據(jù)藥物小分子與生物大分子作用的有關(guān)熱力學參數(shù)可以簡單判斷其相互作用力類型:若ΔHθ<0及ΔSθ<0時,主要表現(xiàn)為氫鍵或范德華作用力;若ΔHθ<0及ΔSθ>0時,主要表現(xiàn)為靜電作用;若ΔHθ>0及ΔSθ>0時,主要表現(xiàn)為疏水作用。從表1可以判斷,吡蟲啉與BHb的結(jié)合是一個自發(fā)過程(ΔGθ<0);吡蟲啉與BHb結(jié)合的ΔHθ<0,ΔSθ>0,可以認為吡蟲啉與BHb分子間主要存在靜電作用;此外吡蟲啉分子中含有吡啶基,吡啶基為平面共軛雜環(huán),插入蛋白質(zhì)的疏水空腔,可以與色氨酸殘基上的吲哚環(huán)通過π-π共軛作用形成電子轉(zhuǎn)移復合物,由于反應的ΔHθ數(shù)值較小,ΔGθ主要來源于熵變的貢獻,在吡蟲啉與BHb相互作用的穩(wěn)定性中熵變效應占有一定地位,因此吡蟲啉與BHb分子間可能也存在著疏水作用力。2.4brb分子中吡蟲啉的檢測同步熒光具有靈敏度高和選擇性好等優(yōu)點,通過選擇合適的波長差可將在普通熒光光譜上相互重疊的熒光峰分開。對于蛋白質(zhì)的同步熒光光譜,△λ=15nm時僅表現(xiàn)為酪氨酸殘基的熒光,△λ=60nm時則顯示色氨酸殘基的熒光。因殘基的最大發(fā)射波長與其所處環(huán)境的極性有關(guān),故由發(fā)射波長的改變可判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。若最大發(fā)射波長紅移,表明殘基所處環(huán)境的極性增加,疏水性降低,蛋白結(jié)構(gòu)變得疏松;藍移則疏水性增加,蛋白結(jié)構(gòu)變得緊密。固定BHb濃度,逐漸增大吡蟲啉的濃度,繪制BHb的同步熒光光譜。分別選擇