植物組織培養(yǎng)中的污染

植物組織培養(yǎng)中的污染

植物組織培養(yǎng)是20世紀(jì)初發(fā)展起來的一項新興技術(shù)。隨著這項技術(shù)的日益完善，其應(yīng)用也越來越廣泛。它可以用于快速繁殖種子、植物消毒、植物育種、細菌血漿保護和二次代謝提取。尤其植物快繁和脫毒是應(yīng)用最多和最廣的方面,而且許多花卉苗木的試管育苗已進入了商品化生產(chǎn)。但是在組織培養(yǎng)過程中,常常會出現(xiàn)一些困難使試驗無法進行下去,甚至導(dǎo)致整個試驗失敗,給科研和工廠化生產(chǎn)帶來損失。污染是組織培養(yǎng)中經(jīng)常遇到的困難。污染是指在植物組織培養(yǎng)過程中,培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌,最終導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象?，F(xiàn)將在矮牽牛、菊花、樹莓等組織培養(yǎng)研究中的一些體會,從污染的原因、影響因素和防止措施幾方面進行淺析,為科研和工廠化生產(chǎn)提供一定的參考價值。1最終組培失敗在培養(yǎng)過程中污染是經(jīng)常發(fā)生的。它會導(dǎo)致培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料上滋生雜菌,最終組培失敗。在科研和商品化生產(chǎn)種苗中,污染率是與經(jīng)濟效益緊密相關(guān)的一個重要指標(biāo),控制污染率無疑是一項提高經(jīng)濟效益、節(jié)約材料的有效途徑之一。因此,探討和重視污染在科研和生產(chǎn)中顯得十分重要。1.1污染的病原體在矮牽牛、菊花、樹莓等的組培過程中,發(fā)現(xiàn)了不同程度的污染現(xiàn)象,其污染物主要是真菌(木霉、青霉、曲霉、毛霉)和細菌。1.2細菌污染的原因真菌性污染主要指霉菌引起的污染。一般接種后3~8d可在培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)各種顏色的菌斑。真菌性污染,一般多由接種室內(nèi)的空氣不潔凈、超凈工作臺的過濾效果不理想、操作不慎等原因引起。細菌性污染的主要癥狀是材料附近出現(xiàn)黏液狀和發(fā)酵泡沫狀物體,或在材料附近的培養(yǎng)基中出現(xiàn)混濁和云霧狀痕跡。一般在接種后1~2d即可發(fā)現(xiàn)。細菌性污染除外植體帶菌或培養(yǎng)基滅菌不徹底外,主要是操作人員的不慎造成。除要求操作人員嚴(yán)格按照無菌操作程序操作外,外植體帶菌引起的污染與外植體的種類、取材季節(jié)、部位、預(yù)處理方法及消毒方法等密切相關(guān)。2影響污染的因素2.1培養(yǎng)外植體時要注意降低污染率植物組織培養(yǎng)的成敗除與培養(yǎng)基的組分有關(guān)外,另一個重要因素就是外植體本身,即由活體植物上切取下來,用以進行離體培養(yǎng)的那部分組織或器官。為了使外植體適于在離體條件下生長,使組織培養(yǎng)工作順利進行,有必要對外植體進行選擇與處理。首先,應(yīng)該從田間或溫室中生長健壯的無病蟲害的植株上選取發(fā)育正常的器官或組織作為外植體,離體培養(yǎng)易于成功。對于大多數(shù)植物來說,莖尖是較好的外植體,由于莖形態(tài)已基本建成,生長速度快,遺傳性穩(wěn)定,病毒含量低或無病毒,所以是獲取無病毒苗的良好途徑。但是,不同植物的不同部位,由于其本身的生長特點,在外植體培養(yǎng)中也存在著各種差異性。比如,各部位的分化再生能力不同,各部位接種后的污染率也不同,各部位培養(yǎng)形成的再生植株的脫毒率也不同。所以選取外植體時應(yīng)選擇適當(dāng)大小的、病毒含量低的、易于消毒和滅菌的外植體,這樣才能保證在組織培養(yǎng)中污染率低、脫毒率高、成活率高。如在芳香植物唇萼薄荷的組織培養(yǎng)中,由于其組織非常柔嫩且表面密生絨毛,在自然條件下,表面常被霉菌和細菌污染。所以在培養(yǎng)時,選取去掉葉片的帶腋芽的幼嫩莖段進行繁殖,這樣既能降低污染率(因為去除了污染率較高的葉片),又能提高成活率。還如在廣佛手的組織培養(yǎng)中,不同外植體的頂芽的污染率最低,成活率最高,葉片次之,帶節(jié)莖的污染率最高。另外,不同季節(jié)取材的外植體,污染率也不同。如在廣佛手的培養(yǎng)中,春季取材與秋季取材差別不大,夏季污染率就高,明顯高于冬季。因此,適當(dāng)?shù)臅r候取材會降低污染率。所以,為了降低污染率、提高成活率,選取外植體應(yīng)該從多方面考慮。2.2組織培養(yǎng)環(huán)境對污染率的影響在培養(yǎng)室內(nèi)的培養(yǎng)條件中,溫度和濕度與污染率密切相關(guān)。外植體在夏季培養(yǎng)時,由于夏天高溫高濕有利于雜菌滋長,所以污染率就高;冬季培養(yǎng)時,污染率就相對低一些。如在廣佛手、矮牽牛、菊花、樹莓的組織培養(yǎng)中,外植體在夏季污染率和死亡率就高;在冬季就相對低一些。此外,一些用于組織培養(yǎng)的植物,在自然條件下的生長環(huán)境也會影響污染率。有報道指出,生長在高溫多雨的熱帶、亞熱帶植物和多年生木本植物容易出現(xiàn)內(nèi)生細菌的污染。內(nèi)生細菌存在于植物材料內(nèi)部,不能被一般的表面消毒方法所清除,隨著材料帶入培養(yǎng)過程引起污染。3避免措施組織培養(yǎng)中降低污染率是不可忽視的技術(shù)環(huán)節(jié)。以下是在矮牽牛、菊花、樹莓等的組織培養(yǎng)中總結(jié)出來的幾點污染防止措施。3.1植株或植株的選擇和快速復(fù)育為了防止材料帶菌,我們在采集外植體時,應(yīng)注意以下幾點:在生長健壯的無病蟲害的植株上選取發(fā)育正常的組織或器官;或?qū)⒛凵也杉貋?放在潔凈的空氣中水培抽芽,然后用這種新生組織培養(yǎng),也可以避免污染。在晴天中午采集外植體。采集易于消毒和滅菌的組織部位進行培養(yǎng),也可以降低污染率。3.2合理使用消毒藥劑外植體在接種之前,須經(jīng)嚴(yán)格的滅菌。由于滅菌劑的種類不同,殺菌力不同,因此選擇消毒劑,既要考慮具有良好的消毒、殺菌作用,同時又易被蒸餾水沖洗掉或能自行分解的物質(zhì),而且不會損傷或輕微損傷組織材料,而不影響生長。植物種類不同,外植體不同,處理也不同。為了獲取無菌材料,對室外采集來的外植體,先用自來水沖洗干凈,然后根據(jù)材料的不同,選用不同種類的滅菌劑,進行不同時間的表面滅菌。選擇適宜的消毒劑處理時,為了使其消毒效果更為徹底,有時還需與黏著劑或潤濕劑如吐溫及抽氣減壓方法、磁力攪拌、超生振動等方法配合使用,使消毒劑能更好地滲入外植體內(nèi)部,達到理想的消毒效果。如在芳香植物唇萼薄荷組織培養(yǎng)中,由于腋芽密生絨毛且部位通常較隱蔽,似很難與消毒液徹底接觸,致使消毒效果不理想,于是在飽和漂白粉溶液中加入0.1%Tween-80混合均勻,并采用軟毛刷輕輕刷洗材料,尤其是腋芽部位,這樣可以使消毒液與材料充分接觸,使消毒效果明顯提高。此外,如果在繼代培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)污染,我們可以采用抗生素(如青霉素、氨芐青霉素等)和殺菌劑(如多菌靈、代森鋅等)處理結(jié)合常規(guī)消毒,重新得到無菌苗。再者,在一些快繁體系連續(xù)多次繼代后,部分試管苗插入培養(yǎng)基的切口處會出現(xiàn)云霧狀污染苗。對于這種污染,我們也可以采取在繼代培養(yǎng)基中加入適量抗生素(如青霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素等)來替代抑菌。但是隨著繼代次數(shù)的增多,抗生素對污染苗的抑菌作用可能會降低,一方面是由于抗生素的消耗,另一方面可能是由于菌類對抗生素產(chǎn)生了耐藥性。3.3滅菌鍋內(nèi)的私家車分裝后的培養(yǎng)基封口后應(yīng)盡快進行高溫高壓滅菌。滅菌不及時,會造成雜菌大量繁殖,使培養(yǎng)基失去效用。為了保證培養(yǎng)基滅菌徹底,降低污染,在滅菌過程中需注意以下幾個環(huán)節(jié):滅菌加熱過程中應(yīng)使滅菌鍋內(nèi)的冷空氣放盡,以保證滅菌徹底;鍋內(nèi)滅菌物不能堆放過滿,否則,將阻礙蒸汽的流通和熱交換,使容器內(nèi)升溫減慢,造成物體內(nèi)部殺菌不完全;滅菌后,應(yīng)切斷電源,使滅菌鍋內(nèi)的壓力緩慢降下來,接近“0”時,才可打開放氣閥,排出剩余蒸汽后,打開鍋蓋取出培養(yǎng)基。千萬別急于取出培養(yǎng)基而打開放氣閥,這樣會造成降壓過快,使容器內(nèi)外壓差過大,液體溢出,造成浪費、污染,甚至危機人身安全。3.4接種器械的使用接種的基本技術(shù)環(huán)節(jié)是降低污染率的關(guān)鍵措施。在接種中,為了降低污染,應(yīng)注意以下幾項事宜:接種室保持干凈整潔,應(yīng)定期對接種室進行噴霧降塵和熏蒸滅菌,并在每次接種前對接種室進行20~30min的紫外滅菌。接種過程中操作人員應(yīng)及時用75%酒精擦拭雙手和超凈工作臺臺面。接種器械應(yīng)及時在酒精燈火焰上進行灼燒滅菌,或在接種器械殺菌器中及時滅菌。在接種過程中,盡量少說話或咳嗽,避免呼吸污染。超凈工作臺上應(yīng)保持氣流暢通,使操作區(qū)空氣不斷凈化。當(dāng)打開培養(yǎng)瓶接種時,培養(yǎng)瓶應(yīng)拿