差速離心法和密度梯度法提取完整葉綠體的比較

差速離心法和密度梯度法提取完整葉綠體的比較

葉綠體是植物細胞獨特的能量轉化細胞器，光合作用是葉綠體。具備高完整度的葉綠體的分離是光合作用及其調控機理研究中的一項經常使用的技術。關于此技術,國內外有不少報道是需用高速冷凍離心機,這就使這一技術的普遍使用受到了極大地限制。在參考文獻的過程中,我們注意到利用普通的臺式離心機也可以得到完整度、得率高的葉綠體。本著使葉綠體制備更加簡單易行且葉綠體得率較高的目的,我們嘗試在低速離心的基礎之上,進一步探討葉綠體制備方法的優(yōu)化。1.材料和方法1.1植物材料選取早晨剛見太陽不久的菠菜葉片,以葉片挺拔厚嫩為佳。1.2試管架和量片的制備普通離心機、研缽、粗天平、顯微鏡、燒杯6個、250ml量筒1個、滴管20支、10ml刻度離心管20支、試管架5個、紗布若干、載片和蓋片各4片、電子天平。1.3mol/l葡萄糖溶液、0.4ol/l甘露醇溶液ros0.35mol/L氯化鈉溶液、0.4mol/L蔗糖溶液、0.4mol/L葡萄糖溶液、0.4mol/L甘露醇溶液(溶液中20mMtris、15mMNaCl、2mMEDTA、PH約為7.5)、80%丙酮、鹽酸、氫氧化鈉、石英砂、蔗糖。1.4方法步驟1.4.1研磨法lnacl溶液(1)選取新鮮的嫩菠菜葉,洗凈擦干后去除葉梗脈,稱10g至30ml0.35mol/LNaCl溶液中,裝入研缽。(2)研磨勻漿。(3)將勻漿用6層紗布過濾至500ml燒杯中。(6)將上清液在3000r/min下離心20min。棄上清液,沉淀即是葉綠體(混有部分細胞核)。(7)將沉淀用500μl0.35mol/LNaCl溶液懸浮。1.4.2細胞、細胞核的分離(1)取10g菠菜功能葉用預冷的蒸餾水洗凈后吸水紙擦干,液氮研磨后加入30ml懸浮液懸浮。(2)經多層紗布過濾,濾液先經500g4℃離心10min除去完整的細胞和細胞核等,保留上清液。(3)經1500g4℃離心15min棄去上清,沉淀轉移到10ml的離心管中,用60%的蔗糖混合,使該混合物終濃度為55%。(4)往上面緩慢加入35%蔗糖溶液使之形成蔗糖密度梯度,4℃7000g離心1h,完整的葉綠體將出現(xiàn)在蔗糖密度梯度35%~55%兩層之間的綠色層,(5)小心吸取上層蔗糖溶液后將葉綠體轉移到另1支10ml試管中用懸浮介質重新懸浮,4℃7000g30min離心洗滌兩次以除去蔗糖等雜質,所得沉淀即為葉綠體。1.5葉綠體提取的測試方法(1)取葉綠體懸液一滴滴于載玻片上,加蓋玻片后即可在顯微鏡下觀察。(2)檢測葉綠素確定葉綠體的得率。2.結果與分析2.1在正常光顯微鏡下觀察在普通光鏡下,可以看到葉綠體為綠色橄欖形,在高倍鏡下可以看到葉綠體內部含有較深的綠色顆粒,即基粒。2.2葉綠體的觀察在用分光光度計檢測葉綠素含量之前,先進行鏡下觀察,以確保所得懸液中為完整葉綠體。如果所得懸液中為完整葉綠體則所測葉綠素含量的高低與葉綠體的得率成正向對應關系。2.2.1離心液濃度的影響在以蔗糖為介質的差速離心法的步驟(6)中,將上清液分別在2500r/min,3000r/min,3500r/min下離心20min,棄去上清液。據表1,可知3000r/min的離心條件下,葉綠體的得率較高。2.2.2不同糖醇介質對葉綠體分離的要求考慮到蔗糖、葡萄糖等物質,可能成為潛在的代謝產物,故一般避免用蔗糖和葡萄糖作為分離介質,而用山梨醇。但在制備完整葉綠體時,對糖醇介質的要求并不專一。下表所示為四種糖醇做等滲介質時所分離的完整葉綠體比較。據表2,可知不同介質之間的差別不是很大,相對來說氯化鈉的提取效果較好而蔗糖的較差。2.2.3葉綠體分離得的純度將最終所獲懸浮液小心地移入底部放有100μl1M葡萄糖溶液的離心管中,使其處于上層,兩層不混,再于1000r/min下離心30秒,棄上液。把葉綠體分離過程中第一次分離得到的完整葉綠體和第二次分離得到的完整葉綠體的純度進行比較,結果表明,第二次離心后得到的完整葉綠體的純度較高。這主要是因為第二次離心時破碎而密度較小的葉綠體不容易沉入密度大的葡萄糖溶液中,從而使沉淀中破碎葉綠體的比例減小。另外,也可以把第一次分離得到的葉綠體,再用等滲溶液洗滌,并以3000r/min再次離心,則可起“浮選”效果,使得完整葉綠體的純度提高。2.2.4密度梯度溶液配制易出現(xiàn)問題由于密度梯度離心方法需要較高的離心速度而且密度梯度溶液的配制常出現(xiàn)問題,因此實驗結果不理想。對比看來,差速離心的方法比較簡單易行,且效果較好。3.葉綠體得率較高,一般要確定其材料的選擇這次試驗結果表明,通過不同轉速條件下葉綠體提取效果的比較,3000r/min條件下,葉綠體的提取效果較佳。氯化鈉、山梨醇做等滲介質的條件下,葉綠體的提取效果相對較好。葉綠體提取中,緩沖液發(fā)揮著極其重要的作用。試驗中曾嘗試不加緩沖液Tris、EDTA,用0.35mol/L氯化鈉溶液做等滲溶液,結果很不理想。其他條件相同的情況下,加入Tris、EDTA緩沖液,葉綠體得率較高。葉綠體提取中,植物材料的選擇也是十分重要的。菠菜和豌豆是分離完整質體的極好材料,期細胞中含有質體較小而且它們都能在不積累淀粉和酚類物質的條件下生長。菠菜的葉綠體濕重比率高,而豌豆容易生長。因此,葉綠體提取的優(yōu)化方案應是:3000r/min的條件下離心,加緩沖液,選擇好的實驗材料,加保護劑,等滲溶液,并做進一步的純化。(4)取濾液10ml在1000r/min下離心5min,棄沉淀。(5)