鎳柱純化原理及方法

鎳柱親和層析親和層析的原理：利用分子間存在特異性的相互作用，它們之間都能夠進(jìn)行專一而又可逆的結(jié)合，這種結(jié)合力就稱為親和力。常見具有專一性親和力的生物分子對：酶： 基質(zhì)類似物，抑制劑，輔酶抗體： 抗原，病毒，細(xì)胞細(xì)胞： 細(xì)胞表面特異蛋白，外源凝集素核酸： 互補(bǔ)堿基序列，組蛋白，核酸聚合酶激素或藥物： 受體，載體蛋白外源凝集素： 多糖，糖蛋白，細(xì)胞表面受體，細(xì)胞文獻(xiàn)將被固定在色譜基質(zhì)上的分子稱為配體，配體和基質(zhì)是共價結(jié)合的，構(gòu)成親和層析的固定相，稱為親和吸附劑。配體以共價鍵結(jié)合到活化的基質(zhì)上，構(gòu)成固相載體。一般載體采用瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝照、聚丙烯酰胺凝膠和纖維素等。INHINHRFigureLInteractionbetweenneighboringreiiduesinthe6xHistagandNi-NTAmaJiix.咪唑環(huán)：是1,3二氮雜戊環(huán)，英文名是Imidazole,如果在第一位或第三位上的氮原子上去掉那個氫原子所剩余的部份，就叫咪唑基。就是咪唑上去掉一個和氮原子直接相連的氫原子后剩下的部分

組氨酸的性質(zhì)：具有弱疏水性、咪唑環(huán)為弱電性。金屬離子：Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+等過渡金屬離子可與N、S和O等供電原子產(chǎn)生配位鍵，因此可與蛋白質(zhì)表面的組氨酸（His）的咪唑基、半胱氨酸（Cys）的巰基和色氨酸（Trp）的吲哚基發(fā)生親和結(jié)合作用，其中以His的咪唑基的結(jié)合作用最強(qiáng)。過渡金屬離子與咪唑基的結(jié)合強(qiáng)弱順序是Cu2+>Ni2+>Zn2+±Co2+。鎳離子：有六個螯合價位，通常將鎳柱分為了Ni-NTA和Ni-IDA。Ni-NTA螯合了四價，剩余兩價；而Ni-IDA螯合三價，剩余三價。因此Ni-IDAAgarose結(jié)合作用力要比Ni-NTAAgarose強(qiáng)，在同樣條件下Ni-IDAAgarose的載量要比Ni-NTA高，而且洗脫雜質(zhì)和目標(biāo)蛋白所用的緩沖液中咪唑濃度更高；但Ni-NTA更穩(wěn)定,耐受更強(qiáng)的還原劑，鎳離子更不易脫落。因此需要根據(jù)不同的純化條件選擇純化所需的鎳柱，以達(dá)到純化的最佳效果?；|(zhì)：不溶性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，滲透性好；物理和化學(xué)穩(wěn)定性高，有較高的機(jī)械強(qiáng)度，使用壽命長；抗微生物和酶的侵蝕；最好為粒徑均一的球形粒子；具有親水性，無非特異性吸附；含有可活化的反應(yīng)基團(tuán)，利于親和配體的固定化。例：瓊脂糖凝膠微球的商品名為Sepharose，含糖濃度為2%、4%、6%時分別稱為2B、4B、6B。Sepharose4B的結(jié)構(gòu)比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B應(yīng)用最廣。配基：是可以可逆結(jié)合特定分子或特定基團(tuán)的分子，能夠通過親和色譜的方式進(jìn)行純化。配基的選擇受到兩種因素的影響：(1)：配基與目標(biāo)物的結(jié)合必須具有特異性和可逆。(2)：必須具有化學(xué)修飾基團(tuán)，使它吸附在基質(zhì)上，并且不損害它的活性。間隔臂：目標(biāo)蛋白質(zhì)的結(jié)合位點位于分子中較深的部位，如果將配基直接偶聯(lián)到基質(zhì)上，受到空間位阻的影響，配基不能到達(dá)目標(biāo)蛋白的結(jié)合位點，因此與目標(biāo)蛋白的結(jié)合能力低。于是在配基與基質(zhì)之間插入一個間隔臂可以使結(jié)合更加容易。間隔臂使結(jié)合最大化的同時要避免非特異性結(jié)合。間隔臂的長度是關(guān)鍵，太短，無效;太長，發(fā)生非特異性結(jié)合。一般規(guī)則：偶聯(lián)的分子量小于1000時使用間隔臂；當(dāng)大分子量，則不一定要。二硫鍵：蛋白質(zhì)的的二硫鍵在半胱氨酸殘基的硫醇之間形成，包內(nèi)蛋白離開細(xì)胞后，二硫鍵常以氧化狀態(tài)存在。此鍵在蛋白質(zhì)分子的立體結(jié)構(gòu)形成上起著一定的重要作用。為了確定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，首先必須將二硫鍵打開，使成為線狀多肽鏈。上樣方式：(1)直接上樣(2)間接上樣洗脫方式：(1)pH值洗脫：pH的改變可以改變帶電荷的配基基團(tuán)和結(jié)合蛋白的離子化程度，使它們結(jié)合位點的親和性降低。(降低pH的方法)(2)離子強(qiáng)度洗脫：(3)競爭性洗脫：(咪唑)再生：(1)先用強(qiáng)變性劑6M鹽酸胍沖洗柱子用水沖洗干凈0.2%SDS沖洗柱子用水沖洗干凈50%乙醇沖洗柱子用水沖洗干凈用100mMEDTA(50mMTris100mMEDTAPH8.0)沖洗柱子用水沖洗干凈用100mM硫酸鎳孵育柱子20%乙醇中4°C保存上清緩沖液及配方

LysisBuffer50mMTris-HCl；150mMNaCl；20mMImidazole；pH8.0；ElutionBuffer150mMTris-HCl；150mMNaCl；50mMImidazole；pH8.0；ElutionBuffer250mMTris-HCl；150mMNaCl；100mMImidazole；pH8.0；ElutionBuffer350mMTris-HCl；150mMNaCl；300mMImidazole；pH8.0；包涵體緩沖液及配方IBElutionBuffer1IBElutionBuffer150mMTris-HCl；IBElutionBuffer250mMTris-HClIBElutionBuffer350mMTris-HClIBElutionBuffer450mMTris-HClIBElutionBuffer550mMTris-HCl150mMNaCl；20mMImidazola；8Murea；pH8.0；150mMNaCl；50mMImidazola；8MureapH8.0；150mMNaCl；100mMImidazola；8MureapH8.0；150mMNaCl；300mMImidazola；8MureapH8.0；150mMNaCl；500mMImidazola；8MureapH8.0；IBLysisBuffer120mMTris；150mMNaCl；2mMEDTA；2mMDTT；1%TritonX-100；PH8.0；IBLysisBuffer250mMTris-HCl；150mMNaCl；8Murea； pH8.0；包涵體純化緩沖液配方試劑及作用1.TritonX-100（曲拉通）：具親水端和疏水端，可將膜蛋白從細(xì)胞膜上解離下來，達(dá)到提取膜蛋白的作用。常用的非離子性去垢劑。用量：l%-3%TritonX-100。TCEP（三（2-羧乙基）膦）：是一種非常有效的硫醇類還原劑，廣泛用作蛋白質(zhì)化學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)研究中二硫鍵的定量還原劑。該試劑在水溶液中的穩(wěn)定性和溶解性都很好。在酸性、堿性溶液中的穩(wěn)定性也不錯。與其他類別的硫醇類還原劑如DTT相比，TCEP不僅是一種高效的二硫鍵還原劑，而且在某些巰基的交聯(lián)反應(yīng)中不需要除掉。用量：1mM/ml.Pepstatin（胃蛋白酶抑制劑）：抑制酸性蛋白酶，配置時溶于甲醇中，在水中不溶解。用量：lug/ml。Storeat:-4°C（Aweek）/-20°C（Halfayear）。Leupeptin（亮抑蛋白酶肽）：抑制絲氨酸和巰基蛋白酶，配置時溶于水，用量：1ug/ml。Storeat:-4C（Aweek）/-20C（Halfayear）。EDTA（乙二胺四乙酸）：螯合劑，消除微量重金屬導(dǎo)致的酶催化反應(yīng)中的抑制作用。不影響蛋白質(zhì)功能的情況下去除干擾金屬離子，但是同時能使金屬蛋白酶喪失活性。用量：0.1—5mmol/L。Glycerol（甘油）：增加黏度，減少分子間的碰撞，用量：5%-30%。7.SDS（十二烷基硫酸鈉）：能夠使蛋白質(zhì)變性的陰離子型去污劑,用量:0.1%-1%。TritonX-114（曲拉通）：溫度在22C以上時，在蛋白質(zhì)溶液中加入2%的TritonX-114可使蛋白質(zhì)從去垢劑相和液相中分離，可溶性蛋白在液相中，而膜蛋白則進(jìn)入了去垢相中。（內(nèi)毒素存在于細(xì)胞壁組分，菌裂解后釋出物中。）DTT（二硫蘇糖醇）：常常被用于蛋白質(zhì)中二硫鍵的還原，可用于阻止蛋白質(zhì)中的半胱氨酸之間所形成的蛋白質(zhì)分子